背景^[1-7]

外泌體micRNA相關(guān)基因PCR檢測服務(wù)是運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對細(xì)胞外泌體micRNA相關(guān)基因的種類及豐度的檢測服務(wù)。外泌體(Exosome)是由細(xì)胞分泌而來的微小囊泡，直徑約為30-100 nm，具有杯狀形態(tài)、雙層膜結(jié)構(gòu)，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和細(xì)胞培養(yǎng)基等生物體液中。包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)幾乎所有類型的細(xì)胞（免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、干細(xì)胞)，都可以產(chǎn)生并釋放exosome。

Exosome可通過細(xì)胞膜受體直接激活受體細(xì)胞，也可運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至細(xì)胞器進(jìn)入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊。Exosome在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血管生成、凋亡、凝血和廢物處理等生理過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。

miRNA是一類22nt左右大小的非編碼分子，它可以通過外泌體從一個(gè)地方轉(zhuǎn)運(yùn)到另外一個(gè)地方行使基因沉默功能。通過檢測外泌體中miRNA表達(dá)變化，可以發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA特異性功能。外泌體（Exosomes）廣泛分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液中。它是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小膜泡，大小為30-150nm左右。外泌體可以攜帶豐富的RNA、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在細(xì)胞和組織之間自由穿梭，參與細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)。外泌體廣泛參與了機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原呈遞、細(xì)胞分化、腫瘤生長于侵襲等多種生物過程。

外泌體是指包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡(30-150nm)。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。

所有培養(yǎng)的細(xì)胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。外泌體的功能取決于其所來源的細(xì)胞類型，其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等方方面面。有研究表明腫瘤來源的外泌體參與到腫瘤細(xì)胞與基底細(xì)胞的遺傳信息的交換，從而導(dǎo)致大量新生血管的生成，促進(jìn)了腫瘤的生長與侵襲。

應(yīng)用^[8][9]

外泌體micRNA相關(guān)基因PCR檢測服務(wù)可用于外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究：

mi R-193b在多種腫瘤細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮著重要的抑制作用,并且與患者的臨床病理特征和預(yù)后聯(lián)系緊密。RAB22A是原癌基因RAS家族的成員,在外泌體的形成,運(yùn)輸和代謝中起重要作用,并且與多種人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),但其在乳腺癌中具體的作用機(jī)制仍不清楚。外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌至細(xì)胞外的微囊泡,依靠其內(nèi)含有的特殊遞質(zhì)成分在細(xì)胞之間傳遞特殊的生物信號(hào),從而影響到腫瘤細(xì)胞的生長能力。

在本文中我們將通過檢測細(xì)胞與組織中RAB22A基因與mi R-193b的表達(dá)水平,明確在不同樣本中二者表達(dá)水平間的相互關(guān)系;探討調(diào)控RAB22A表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用及與mi R-193b的關(guān)系;研究RAB22A基因所介導(dǎo)的外泌體產(chǎn)生與發(fā)揮功能在乳腺癌細(xì)胞生長中所起到的作用。這些研究可能對乳腺癌的靶向治療方式的選擇具有一定意義。

方法:檢測RAB22A與mi R-193b的表達(dá):收集242例浸潤性乳腺癌患者的組織,以及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-468、ZR-75、T47D和乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,通過RT-q PCR及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測RAB22A與mi R-193b的表達(dá)水平及相對關(guān)系。此外,用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析這部分患者癌組織內(nèi)RAB22A的表達(dá)水平,探討其與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等乳腺癌預(yù)后影響因素間的關(guān)系。利用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)價(jià)高表達(dá)RAB22A基因?qū)颊哳A(yù)后的影響能力。

建立低表達(dá)RAB22A基因的細(xì)胞模型:分別建立mi R-193b過表達(dá)的MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞模型,利用RT-q PCR檢測實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞中mi R-193b的表達(dá),證實(shí)轉(zhuǎn)染效果;同時(shí)觀察過表達(dá)mi R-193b后對于RAB22A的影響。在過表達(dá)mi R-193b的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染去除了mi R-193b結(jié)合位點(diǎn)的pc DNA3.1-RAB22A或pc DNA3.1,觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長情況,證實(shí)RAB22A與mi R-193b的調(diào)節(jié)關(guān)系;使用克隆有HBLV-RAB22A sh RNA-Puro(sh RAB22A)的慢病毒感染MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞,HBLV-Scramble-Puro control(SC)用于陰性對照,利用RT-q PCR及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAB22A基因的敲減效果。

參考文獻(xiàn)

[1]Suresh Mathivanan,Hong Ji,Richard J.Simpsonet al.Exosomes:Extracellular organelles important in intercellular communication Journal of proteomics 7 3(2010)1907–1920

[2].Richard J Simpson†,Justin WE Lim,Robert L Moritz andSuresh Mathivanan et al.E xosomes:proteomic insightsand diagnostic potential.Expert Rev.Proteomics 6(3),267–283(2009)

[3]Hadi Valadi,Karin Ekström1,Apostolos Bossios,Margareta Sjöstrand1,James J.Lee and Jan O.Lötvall et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.Nat Cell Biol 2007;9:654–9.

[4]Andersen JS,Mann M.Organellar proteomics:turning inventories into insights.EMBO Rep 2006;7:874–9.

[5]Piccin A,Murphy WG,Smith OP.Circulating microparticles:pathophysiology and clinical implications.Blood Rev 2007;21:157–71.

[6]del Conde I,Shrimpton CN,Thiagarajan P,Lopez JA.Tissue-factor-bearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation.Blood 2005;106:1604–11.

[7]Ratajczak J,Wysoczynski M,Hayek F,Janowska-Wieczorek A,Ratajczak MZ.Membrane-derived microvesicles:important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication.Leukemia 2006;20:1487–95.

[8]Mears R,Craven RA,Hanrahan S,Totty N,Upton C,Young SL,Patel P,Selby PJ,Banks RE.Proteomic analysis of melanomaderived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry.Proteomics 2004;4:4019–31.

[9]孫亮.miR-193b靶向RAB22A基因調(diào)節(jié)外泌體介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究[D].吉林大學(xué),2018.