背景[1-6]
PiRNA定量PCR檢測可以對piRNA的總體表達情況進行檢測。三個物種的piRNA序列都來自NCBI數(shù)據庫，并且使用UCSC Blat技術在HG19,MM9和RN4數(shù)據庫中分別進行染色體定位（map）。我們采用恰當?shù)牟呗詠硖暨x探針，然后使用雙重方法（duplex method）設計60 mer的反義寡核苷酸探針。
piRNA（Piwi-interacting RNA）是從哺乳動物生殖細胞中分離得到的一類非編碼小RNA。成熟的piRNA是一類長約26-32nt的單鏈小RNA分子。在小鼠睪丸內只存在幾百種不同的miRNA，而piRNA卻至少有5萬種。piRNA即使在近緣物種之間保守性也很差，在長度、表達類型和基因結構上則與microRNA截然不同。
piRNA是一類長度為26～31nt單鏈的小RNA，大部分集中在29～30nt。piRNA的表達具有組織特異性，只存在于具有全能性的動物細胞，如生殖細胞、腫瘤細胞和干細胞等。piRNA通過與Piwi亞家族蛋白結合形成piRNA復合物（piRC）來發(fā)揮生物學功能（沉默轉錄基因過程，維持生殖系和干細胞功能，調節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性）。此外，piRNA在一些癌癥細胞中存在異常表達的現(xiàn)象，提示piRNA可能參與癌癥的發(fā)生，并可作為癌癥診斷和治療中的潛在生物標記物。
PiRNA的沉默機制主要利用（1）通過轉錄自與轉座元件（TE）加工而成piRNA，并結合互補結合TE抑制其轉錄；（2）通過編碼蛋白基因區(qū)轉錄加工成piRNA,與AGO3，AUB蛋白形成復合體抑制靶基因；（3）由基因3'UTR轉錄生成piRNA，并結合與PIWI,抑制靶基因；（4）從piRNA簇生成piRNA，并與AUB等蛋白相互作用起到抑制靶基因的目的。（5）另外，piRNA也被報道有起到高甲基化調控的協(xié)同調控行為。
piRNA的生成加工過程途徑（Biogenesis Pathway）主要分為二大類：（a）轉錄自TE轉錄元件或piRNA簇的反義鏈經過加工，加載到蛋白AUB或PIWI上形成功能piRNA。通常piRNA介導的piRISC復合體起到引發(fā)第二種生成加工途徑的激發(fā)作用。（b）通過AUB和AGO3蛋白的剪接體翠功能發(fā)生piRNA擴增效應（即Pingpong循環(huán)反應）。
應用[7][8]
PiRNA定量PCR檢測可用于PiRNA沉默轉錄基因過程；維持生殖系和干細胞功能的研究：
piRNA通路是近年來在多種動物生殖細胞中發(fā)現(xiàn)的小RNA通路,在配子生成、轉座子抑制及維護基因組的完整性方面發(fā)揮著重要的作用。基因組中的轉座現(xiàn)象可能會導致重要基因功能的缺失,在生殖細胞中,轉座子的頻繁活動會導致生殖細胞的凋亡,影響遺傳信息的傳遞,從而威脅物種的生存和繁衍。硬骨魚中轉座子的種類遠遠超過哺乳動物,其在基因組中的周轉頻率也更高。
piRNA通路基因作為在生殖系統(tǒng)中抵抗轉座侵擾、保護基因組的衛(wèi)士,必然受到強大的選擇壓力。大部分硬骨魚都是通過體外受精進行繁殖,生殖細胞通過持續(xù)的有絲分裂和減數(shù)分裂形成更多生殖細胞,piRNA通路基因必須應對轉座帶來的持續(xù)威脅。因此,推測硬骨魚中piRNA通路基因和轉座子存在共進化。調取了21個哺乳動物和8個硬骨魚的18個基因的編碼區(qū)序列,這些基因包括miRNA/siRNA通路基因(Ago家族)和piRNA通路基因。
此外,克隆了黃鱔Ago家族及piRNA通路的9個基因。通過譜系間的選擇壓力分析,以miRNA/siRNA通路基因和β-actin作為對照,發(fā)現(xiàn)piRNA通路基因在硬骨魚中加速進化,同時在這些基因的功能域檢測到了大量的正向選擇位點。發(fā)現(xiàn)了piRNA通路基因在黃鱔中的進化比其它硬骨魚更快,表達譜分析顯示這些基因在黃鱔三種性腺中高表達,為進化分析提供了佐證。
1.黃鱔Ago家族基因和piRNA通路基因的克隆通過設計兼并引物和RACE技術,克隆了黃鱔Ago家族及piRNA通路的9個基因,包括Ago1、Ago2、Ago3a、Ago3b、Ago4、Piwill、Piwil2、Tdrdl及Prmt5。Ago基因是miRNA/siRNA通路的核心蛋白,在進化分析中作為對照基因。通過序列比對和構建系統(tǒng)發(fā)育樹證實了克隆的黃鱔基因確實是該通路的基因。2.黃鱔Ago家族基因和piRNA通路基因的表達分析通過RT-PCR及實時定量PCR分析顯示,Ago家族基因在黃鱔組織中廣譜表達,piRNA通路基因則主要在性腺中表達。
在黃鱔三種性腺中,piRNA通路基因的表達遠高于Ago家族基因,提示它們在黃鱔配子生成和性腺分化中具有重要功能。構建的Ago家族基因和Piwi家族基因的熒光表達載體轉染細胞,發(fā)現(xiàn)這些基因主要在細胞質表達。piRNA通路基因在性腺中的高水平表達說明了其重要作用,從而為進化分析得出的結論提供了佐證。
參考文獻
[1]Using Modeltest and PAUP*to select a model of nucleotide substitution.Posada,D.Current Protocols in Bioinformatics.2003
[2]Whole-genome shotgun assembly and analysis of the genome of Fugu rubripes.Aparicio S,Chapman J,Stupka E,et al.Science.2002
[3]A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes.Aravin Alexei,Gaidatzis Dimos,Pfeffer Sébastien,Lagos-Quintana Mariana,Landgraf Pablo,Iovino Nicola,Morris Patricia,Brownstein Michael J,Kuramochi-Miyagawa Satomi,Nakano Toru,Chien Minchen,Russo James J,Ju Jingyue,Sheridan Robert,Sander Chr.Nature.2006
[4]Cytoplasmic compartmentalization of the fetal piRNA pathway in mice.Aravin Alexei A,van der Heijden Godfried W,Casta?eda Julio,Vagin Vasily V,Hannon Gregory J,Bortvin Alex.PLoS genetics.2009
[5]PiggyMac,a domesticated piggyBac transposase involved in programmed genome rearrangements in the ciliate Paramecium tetraurelia.Baudry Céline,Malinsky Sophie,Restituito Matthieu,Kapusta Aurélie,Rosa Sarah,Meyer Eric,Bétermier Mireille.Genes and Development.2009
[6]piRNA biogenesis during adult spermatogenesis in mice is independent of the ping-pong mechanism.Ergin Beyret,Na Liu,Haifan Lin.Cell Research.2012
[7]AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development.Bohmert K,Camus I,Bellini C,Bouchez D,Caboche M,Benning C.EMBO Journal.1998
[8]易敏寒.脊椎動物piRNA通路基因的分子進化研究[D].武漢大學,2014.