背景[1-7]
Protein G Agarose(Fast Flow,5ml)預(yù)裝柱是一種簡便、快速、高效的用于抗體純化、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)的即用型預(yù)裝柱，也稱層析柱(Chromatography column)或純化柱(Purification column)。也可用于實(shí)驗(yàn)中抗原抗體復(fù)合物的分離純化。天然蛋白A（Protein A）是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一種分離自G型或C型鏈球菌屬的細(xì)胞表面蛋白，二者功能相似，主要通過與免疫球蛋白（Ig）的Fc區(qū)相互作用，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動物的IgG。
然而兩者結(jié)合特異性上有所不同,如蛋白G對人IgG3，大鼠IgG2a，綿羊IgG1具有很高的親和力，但蛋白A對這些Ig結(jié)合力很弱。蛋白A，蛋白G常共價偶聯(lián)在固體載體如瓊脂糖珠或丙烯酸樹脂小珠上，直接用以做免疫沉淀（IP）或者免疫共沉淀（Co-IP）來進(jìn)行蛋白功能相關(guān)研究，或者直接裝在層析柱上來純化單克隆或者多克隆抗體。
Protein G Agarose(Fast Flow,5ml)預(yù)裝柱使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不僅維持其本身的Ig親和特性，同時也去除了天然蛋白本身的非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。本品同時將蛋白A和蛋白G共價偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠微球表面，比單獨(dú)的蛋白A或者蛋白G都有更廣的結(jié)合范圍，適合于所有蛋白A瓊脂糖珠和蛋白G瓊脂糖珠單獨(dú)可以結(jié)合的Ig，實(shí)用性更高。
Protein A是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞壁表面蛋白，分子量為42kDa；Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達(dá)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特異性地與哺乳動物免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)結(jié)合，結(jié)合的部位通常為免疫球蛋白的Fc區(qū)，但有資料顯示Protein A也會和人VH3家族的Fab區(qū)結(jié)合，而Protein G有時與Fab區(qū)也有一定結(jié)合。同時，兩者對于不同的免疫球蛋白亞類的結(jié)合能力有所不同。適當(dāng)重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結(jié)合，可用于抗體的純化.
應(yīng)用[8][9]
Protein G Agarose(Fast Flow,5ml)預(yù)裝柱可用于純化IgG：
在蛋白質(zhì)組學(xué)研究的很長時間內(nèi),天然多肽被視為體內(nèi)代謝的生物垃圾。最近幾年很多研究者發(fā)現(xiàn),多肽作為蛋白代謝產(chǎn)物,反映了體內(nèi)生物代謝過程。多肽組是疾病標(biāo)志物的重要的寶庫,對于腫瘤的早期預(yù)警、早期診斷具有重要的研究意義。肝癌作為世界范圍內(nèi)高發(fā)病率疾病,引起眾多研究者的關(guān)注,其在亞洲,具有與乙肝、肝硬化等密切聯(lián)系的疾病特點(diǎn),因此肝癌的早期預(yù)警技術(shù)研究對于預(yù)防肝癌、預(yù)測肝癌的發(fā)病趨勢具有特殊的研究價值和社會意義。
目前,用于臨床確診的肝癌標(biāo)志物主要還是甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、鱗狀細(xì)胞癌抗原免疫球蛋白M復(fù)合物(SCCA-IgM IC)、α-L-巖藻糖苷酶(AFU)及其他聯(lián)檢標(biāo)志物,最常用的AFP診斷方法對于直徑3cm以下的腫瘤具有診斷局限性。采用傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法制備出2種多肽單克隆抗體:抗SP0104抗體、抗SP0105抗體,在此基礎(chǔ)上使用Protein G Agarose建立了基于多肽抗體和MALDI-TOF-MS的免疫質(zhì)譜方法,使用該方法對兩種多肽標(biāo)準(zhǔn)品SP0104、SP0105進(jìn)行檢測,偏差小于0.5Da。
結(jié)果表明,優(yōu)化后的免疫質(zhì)譜方法適用于血清低濃度多肽的檢測。最后我們比較了有機(jī)溶劑沉淀、超濾、去除IgG和白蛋白、解離白蛋白連接的多肽等4種血清多肽預(yù)處理方法和不處理對免疫質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響,結(jié)果表明不處理時標(biāo)志物檢測值最高。采用通過優(yōu)化的免疫質(zhì)譜方法完成對20例正常血清、20例肝癌血清的檢測,結(jié)果兩組質(zhì)譜峰強(qiáng)度檢測值經(jīng)過t檢驗(yàn),P<0.003,兩組檢測值具有顯著性差異。結(jié)果表明免疫質(zhì)譜方法可用于肝癌多肽血清標(biāo)志物的診斷研究。
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