背景^[1-3]

NOX4抗體是一種可以特異性結(jié)合NOX4的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的NOX4蛋白。NOX4抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

Nox4抗體（C-3）是一種小鼠單克隆IgG2b kappa輕鏈抗體，專門(mén)用于檢測(cè)人類Nox4蛋白，也稱為Renox，是NADPH氧化酶家族的重要組成部分。Nox4通過(guò)產(chǎn)生活性氧（尤其是超氧陰離子）在細(xì)胞氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，而活性氧對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和缺氧反應(yīng)等過(guò)程至關(guān)重要。翻譯后修飾（如磷酸化）可調(diào)節(jié)Nox4的活性，并促進(jìn)其與p47-phox和p67-phox等蛋白的相互作用，這些蛋白對(duì)于組裝活性NADPH氧化酶復(fù)合物是必不可少的。此外，Nox4還與TGF-β等通路中的關(guān)鍵信號(hào)蛋白相互作用，從而凸顯其在纖維化和血管重塑等過(guò)程中的作用。

將抗Nox4抗體（C-3）用于蛋白質(zhì)印跡（WB）、免疫沉淀（IP）、免疫熒光（IF）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA），這些應(yīng)用中均能證明其與人類Nox4的反應(yīng)性。Nox4在腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞中大量表達(dá)，Nox4有助于促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，此外在胎兒組織、胎盤(pán)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和血管細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。在血管細(xì)胞中，Nox4表達(dá)會(huì)因血管緊張素II而上調(diào)，這強(qiáng)調(diào)了Nox4在血管氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要性及其對(duì)心血管疾病的潛在影響。Nox4(C-3)抗體適用于研究Nox4在各種生物學(xué)環(huán)境中的不同功能和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究人員。

NOX4抗體

NOX4抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（NOX4抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(NOX4抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

NOX4抗體可以用于剪接調(diào)控蛋白ESRP1和NOX4對(duì)氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用的研究

探討ESRP和NOX4對(duì)慢性阻塞性肺疾病上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)的影響,以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)上皮剪切過(guò)程。

研究方法:1、建立COPD煙熏小鼠模型,探索ESRP1、NOX4與小鼠氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的關(guān)系:在廣州醫(yī)科大學(xué)EC的審核下,我們從C57BL/6J周齡的((8-10周齡、18-20g/只)共48只,隨機(jī)分為對(duì)照組(空氣暴漏組)和CS組(煙霧暴漏組),造模時(shí)間12周及24周后麻醉狀態(tài)下處死;分別于造模12周及24周后均行肺功能檢測(cè)評(píng)估COPD造模效果,留取外周血及肺泡灌洗液通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)、吉姆薩染色等檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性指標(biāo),留取肺組織通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、蛋白免疫印跡等檢測(cè)ESRP1、NOX4及ECM標(biāo)志物。2、體外BEAS-2B細(xì)胞研究ESRP1、NOX4在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及可能的信號(hào)機(jī)制:培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞系(BEAS-2B),分別用CSE、TGFβ1干預(yù)細(xì)胞后,使用NOX4抗體免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光定量檢測(cè)ESRP1、NOX4及ECM標(biāo)志物,流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。通過(guò)ELISA技術(shù),我們可以測(cè)量培養(yǎng)基上清中MDA和SOD3的表達(dá)水平,并使用NOX4抑制劑GKT138731對(duì)BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,然后再使用TGFβ1繼續(xù)作用,以NOX4抗體蛋白免疫印跡技術(shù)來(lái)檢測(cè)ESRP1和ECM標(biāo)志物的表達(dá),以確保細(xì)胞的健康。此外,我們還可以使用NAC技術(shù),在細(xì)胞之間進(jìn)行預(yù)處理,然后再使用TGFβ1繼續(xù)作用,以確保細(xì)胞的健康。通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù),我們可以確定NOX4、ESRP1和ECM標(biāo)志物的表達(dá)水平是否一致。

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