背景^[1-3]

RAB11A抗體是一種可以特異性結(jié)合RAB11A的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的RAB11A蛋白。RAB11A抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

Rab 11A抗體（A-6）既可以是非偶聯(lián)的抗Rab 11A抗體形式，也可以是多種偶聯(lián)形式的抗Rab 11A抗體，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種Alexa Fluor?偶聯(lián)物。Ras相關(guān)的鳥苷酸結(jié)合蛋白超家族，包括Ral/Rec、Rap、R-Ras和Rho/Rab亞家族，與Ras p21具有30-60%的同源性。積累的數(shù)據(jù)表明，Rab蛋白在內(nèi)吞作用或生物合成蛋白轉(zhuǎn)運中起著重要作用。新合成的蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基復(fù)合體的各個部位以及分泌囊泡，每個階段都涉及載體囊泡的移動，這一過程似乎與Rab蛋白的功能有關(guān)。Rab蛋白也可能直接指導(dǎo)從分泌囊泡到質(zhì)膜的胞吐作用，這一可能性得到了以下觀察的支持：在酵母中，與Rab蛋白具有40%同源性的SEC4蛋白與分泌囊泡相關(guān)。已經(jīng)鑒定出Rab亞家族的幾個成員，每個成員都存在于膜轉(zhuǎn)運途徑的特定階段。

RAB11A抗體

RAB11A抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（RAB11A抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(RAB11A抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

RAB11A抗體可以用于Rab11a在上皮性卵巢癌中的表達及其細胞學(xué)功能和作用機制研究

Rab11a在上皮性卵巢癌細胞中的功能研究目的:從腫瘤細胞的增殖、細胞周期分布、侵襲、遷移等方面研究Rab11a在EOC細胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能。

方法:1.培養(yǎng)人正常卵巢上皮細胞HOSEpi C及OC細胞株A2780,SKOV-3,COC1,OVCAR-3;首先用RT-q PCR檢測各組細胞株中Rab11a m RNA表達水平,選擇其中Rab11a表達較高的細胞株定為H,表達較低的細胞株則為L。2.利用lipofectamine 2000,將Rab11a的sh-RNA以及其對照的sh-NC,轉(zhuǎn)染到H細胞,從而實現(xiàn)下調(diào);將Rab11a的過表達質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至L細胞,構(gòu)建過表達模型。RAB11A抗體Western blotting驗證各組細胞中的Rab11a的蛋白水平。3.CCK-8試驗檢測各組細胞的增殖情況;流式細胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測細胞周期分布情況;轉(zhuǎn)染48 h后,Western blotting檢測各組細胞中PCNA和Cyclin D1表達水平。4.細胞劃痕試驗和Transwell試驗進一步檢測各組細胞的遷移能力和侵襲水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細胞上清液中MMP-2、MMP-9的含量。

RAB11A抗體結(jié)果:1.與HOSEpi C細胞相比,四種OC細胞株中Rab11a的m RNA水平均顯著升高。其中,在OVCAR-3細胞中Rab11a m RNA表達水平最高,在A2780細胞中則相對較低。因此,本研究使用sh-RNA對OVCAR-3細胞進行轉(zhuǎn)染下調(diào)了Rab11a的表達,使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細胞上調(diào)了Rab11a的表達,構(gòu)建過表達模型,進行后續(xù)試驗。2.RAB11A抗體Western blotting結(jié)果顯示,在OVCAR-3細胞中,Rab11a蛋白的表達在sh-RNA轉(zhuǎn)染組明顯低于對照組,而在A2780細胞中,Rab11a蛋白的表達在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3.CCK-8試驗結(jié)果表明,相比對照組,下調(diào)Rab11a顯著降低了OVCAR-3細胞的增殖與活性,相反,Rab11a過表達增加了A2780細胞的增殖與活性。FCM分析結(jié)果表明,在OVCAR-3細胞中,與對照組相比,sh-RNA轉(zhuǎn)染組G0/G1期的比例顯著升高,同時相應(yīng)的S期和G2期細胞比例降低(P<0.05)。相反,A2780細胞中Rab11a的過表達導(dǎo)致出現(xiàn)相反的趨勢。此外,Western blotting結(jié)果顯示,Rab11a下調(diào)促使OVCAR-3細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA和Cyclin D1的相對表達量均較對照組降低(P<0.05),而在Rab11a過表達的A2780細胞中,PCNA和Cyclin D1的蛋白表達量則較對照組顯著升高(P<0.05)。

參考文獻

[1]RAB11A Promotes Cell Malignant Progression and Tumor Formation of Prostate Cancer via Activating FAK/AKT Signaling Pathway[J].Chen Weifang;Wang Junjun.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2023

[2]Rab11a promotes the malignant progression of ovarian cancer by inducing autophagy.[J].Wang Yazhuo;Ren Yanan;Li Na;Zhao Jing;Zhao Sufen.Genes&genomics.2022

[3]RAB11A Expression Is Associated With Cancer Aggressiveness Through Regulation of FGFR-Signaling in Lung Squamous Cell Carcinoma.[J].Gombodorj Navchaa;Azuma Yoko;Yokobori Takehiko;ErkhemOchir Bilguun;Kosaka Takayuki;Ohtaki Yoichi;Nakazawa Seshiru;Mogi Akira;Yajima Toshiki;Kuwano Hiroyuki;Saeki Hiroshi;Shirabe Ken.Annals of surgical oncology.2022

[4]A Clinical Diagnostic Value Analysis of Serum CA125,CA199,and HE4 in Women with Early Ovarian Cancer:Systematic Review and Meta-Analysis[J].Qing Xiaolin;Liu Liting;Mao Xiguang;Hussein Ahmed Faeq.Computational and Mathematical Methods in Medicine,2022

[5]王雅卓.Rab11a在上皮性卵巢癌中的表達及其細胞學(xué)功能和作用機制研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2023.