背景^[1-3]

ACAA1抗體是一種可以特異性結(jié)合ACAA1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的ACAA1蛋白。ACAA1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

ACAA1抗體（C-8）既有非偶聯(lián)型抗ACAA1抗體形式，也有多種偶聯(lián)型抗ACAA1抗體形式，包括瓊脂糖、HRP、PE、FITC和多種Alexa Fluor?偶聯(lián)物。哺乳動物組織含有五種硫解酶，它們都參與體內(nèi)各種化合物的代謝。ACAA1（乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶1），也稱為過氧化物酶體3-氧代?；o酶A硫解酶，是硫解酶家族酶的424個氨基酸成員，參與脂質(zhì)代謝。ACAA1定位于過氧化物酶體，在脂肪酸氧化途徑中催化?；o酶A和乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-氧代酰基輔酶A。ACAA1在大鼠的肝、腎、腸和白色脂肪組織中顯示出高酶活性，存在A型和B型兩種類型。人類ACAA1與其大鼠對應(yīng)物具有86%的氨基酸同一性，這表明ACAA1在不同物種間具有保守功能。

ACAA1抗體

ACAA1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（ACAA1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(ACAA1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

ACAA1抗體可以用于喉鱗狀細(xì)胞癌中脂肪酸代謝相關(guān)基因ADRP和ACAA1異常表達(dá)的研究

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其中絕大多數(shù)為喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC),近年來其發(fā)病率呈上升趨勢,其發(fā)病機(jī)制尚不甚清楚,因此學(xué)者們致力于探索喉癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制。腫瘤細(xì)胞能量代謝改變?nèi)鏦arburg效應(yīng)在腫瘤增殖、調(diào)亡、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。脂肪酸是能量代謝的重要底物,腫瘤細(xì)胞中脂肪酸代謝呈異常激活狀態(tài),脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的改變可能影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

探討喉鱗狀細(xì)胞癌中脂肪酸代謝機(jī)制,我們開展本課題研究即脂肪酸代謝相關(guān)基因脂肪相關(guān)分化蛋白(Adipose differentiation-related protein,ADRP)和乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶(Acetyl CoA acyltransferase 1,ACAA1)基因在LSCC中的表達(dá)特點(diǎn),分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,為進(jìn)一步的實驗研究提供理論基礎(chǔ)。研究方法1.通過實時熒光定量PCR方法檢測LSCC中的ADRP和ACAA1基因的轉(zhuǎn)錄水平。2.通過用ACAA1抗體免疫組織化學(xué)染色法從蛋白水平檢測LSCC中ADRP和ACAA1的異常表達(dá)。3.結(jié)合LSCC樣本的臨床特征,分析脂肪酸代謝基因ADRP和ACAA1與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

ACAA1抗體研究結(jié)果1.檢測發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織,ADRP和ACAA1在LSCC中轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。2.LSCC中ADRP和ACAA1的蛋白水平呈明顯表達(dá)下調(diào)。3.ADRP和ACAA1的表達(dá)與LSCC的TNM分期、分化程度有關(guān)。研究結(jié)論脂肪酸代謝相關(guān)基因ADRP和ACAA1在LSCC中異常表達(dá),此外與LSCC的TNM分期、病理分級有關(guān),提示了ADRP和ACAA1的異常表達(dá)可能參與LSCC的發(fā)生發(fā)展過程,為探索LSCC的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Pyrazinamide induced hepatic injury in rats through inhibiting the PPARαpathway[J].Yun Zhang;;Hongli Guo;;Hozeifa M.Hassan;;Ping‐ping Ding;;Yijing Su;;Yuming Song;;Tao Wang;;Lixin Sun;;Luyong Zhang;;Zhenzhou Jiang.Journal of Applied Toxicology,2016(12)

[2]Deguelin Induces Apoptosis by Targeting Both EGFR-Akt and IGF1R-Akt Pathways in Head and Neck Squamous Cell Cancer Cell Lines[J].Yuh Baba;;Masato Fujii;;Toyonobu Maeda;;Atsuko Suzuki;;Satoshi Yuzawa;;Yasumasa Kato;;Sandeep Singh.BioMed Research International,2015

[3]Acetate/acetyl-CoA metabolism associated with cancer fatty acid synthesis:Overview and application[J].Yukie Yoshii;;Takako Furukawa;;Tsuneo Saga;;Yasuhisa Fujibayashi.Cancer Letters.2015

[4]The combinatory effects of PPAR-γagonist and survivin inhibition onthe cancer stem-like phenotype and cell proliferation in bladder cancer cells[J].Yang Wang;;Hailin Tan;;Dongxu Xu;;Aihui Ma;;Li Zhang;;Jiabin Sun;;Zhaojuan Yang;;Yongzhong Liu;;Guowei Shi.International Journal of Molecular Medicine,2014(1)

[5]黃潤春.喉鱗狀細(xì)胞癌中脂肪酸代謝相關(guān)基因ADRP和ACAA1異常表達(dá)的研究[D].廣西醫(yī)科大學(xué),2017.