背景^[1-3]

DDR1抗體是一種可以特異性結(jié)合DDR1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的DDR1蛋白。DDR1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

DDR1（Discoidin domain receptor 1）作為DDRs成員之一，屬于一種新型的受體型酪氨酸激酶（RTKs）。DDR1基因位于人6號染色體的p臂（6p21.3）。DDR1由與配體相互作用的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和通過激酶結(jié)構(gòu)域傳遞信號的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)組成。DDR1有5種亞型，即5個剪接變異體，DDR1a、DDR1b、DDR1c、DDR1d和DDR1e，由外顯子的選擇性剪接或缺失產(chǎn)生。目前，被證實(shí)有生物學(xué)功能的亞型為DDR1a和DDR1b。研究表明，不少蛋白能與活化后的DDR1結(jié)合，非肌肉肌球蛋白重鏈IIA（Non-myscle myosin heavy chain IIA,NMHC-IIA），黏著斑激酶（Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK），STAT3，Lyn等。但某些蛋白與DDR1的結(jié)合不需要DDR1的磷酸化，如多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白、腎腦表達(dá)蛋白、Notch1、E-鈣黏蛋白（Cadherin-1，CADH1）。

DDR1主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，且DDR1與腎臟、肝臟、肺組織的纖維化病變有關(guān)。此外，DDR1酪氨酸激酶在多種腫瘤中均有表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、腦瘤、卵巢癌、食管癌、頭頸部腫瘤、肝癌、睪丸癌等，其高表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)。鑒于DDR1功能的改變和腫瘤的發(fā)展之間的聯(lián)系，使得DDR1成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。目前，已有多款靶向DDR1在研臨床藥物，主要用于癌癥治療。

DDR1抗體

DDR1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（DDR1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(DDR1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

DDR1抗體可以用于盤狀結(jié)構(gòu)域受體1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究

探索了DDR1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其潛在分子機(jī)制。方法:1.相同遺傳背景的野生(WT)小鼠和DDR1基因敲除(KO)小鼠通過腹腔注射CCL4(0.5mL/kg)建立肝纖維化模型,采集外周血并收集肝臟進(jìn)行分析。通過血清生化指標(biāo)測定,組織病理學(xué)觀察及纖維化指標(biāo)的檢測,分析DDR1與肝纖維化的相關(guān)性。2.建立肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞的間接共培養(yǎng)體系,體外研究肝細(xì)胞DDR1對肝星狀細(xì)胞的影響。通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建DDR1高表達(dá)或敲減的肝細(xì)胞L02和HepG2細(xì)胞株,在Ⅰ型膠原刺激后收集肝細(xì)胞條件上清,用上述條件上清孵育LX2細(xì)胞后研究DDR1對肝星狀細(xì)胞活化表型、增殖能力及膠原合成的促纖維化特性的影響。通過Ⅰ型膠原刺激不同DDR1表達(dá)水平肝細(xì)胞后,DDR1抗體檢測DDR1對肝細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子表達(dá)的影響,并使用中和抗體對肝細(xì)胞條件上清進(jìn)行干預(yù)后觀察肝細(xì)胞DDR1對肝星狀細(xì)胞相關(guān)促纖維化特性的影響,以闡明DDR1通過對肝細(xì)胞旁分泌作用的調(diào)控來影響肝星狀細(xì)胞促纖維化特性的作用。3.檢測在Ⅰ型膠原刺激下肝細(xì)胞DDR1的活化,相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和相關(guān)通路蛋白的活化,在通路蛋白抑制劑預(yù)處理后再次檢測相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),通過探究參與DDR1調(diào)控肝細(xì)胞促纖維化因子表達(dá)的相關(guān)信號通路來進(jìn)一步闡明DDR1調(diào)控肝細(xì)胞促纖維化介質(zhì)表達(dá)的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]The burden of liver cirrhosis in mortality:Results from the global burden of disease study[J].Ye Fei;Zhai Mimi;Long Jianhai;Gong Yi;Ren Chutong;Zhang Dan;Lin Xiang;Liu Sushun.Frontiers in Public Health.2022

[2]Intestinal peroxisome proliferator-activated receptorα-fatty acid-binding protein 1 axis modulates nonalcoholic steatohepatitis.[J].Yan Tingting;Luo Yuhong;Yan Nana;Hamada Keisuke;Zhao Nan;Xia Yangliu;Wang Ping;Zhao Changdong;Qi Dan;Yang Shoumei;Sun Lulu;Cai Jie;Wang Qiong;Jiang Changtao;Gavrilova Oksana;Krausz Kristopher W;Patel Daxesh P;Yu Xiaoting;Wu Xuan;Hao Haiping;Liu Weiwei;Qu Aijuan;Gonzalez Frank J.Hepatology(Baltimore,Md.).2022

[3]Activation of mitophagy by rapamycin eliminated the accumulation of TDP-43 on mitochondrial and promoted the resolution of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice[J].Yong Hui;Shan Shulin;Wang Shuai;Liu Zhidan;Liu Zhaoxiong;Zhang Cuiqin;Yang Yiyu;Huang Zhengcheng;Song Fuyong.Toxicology.2022

[4]Role of macrophages in liver cirrhosis:fibrogenesis and resolution.[J].Elsherif Sherine Ahmed;Alm Ahmed Salah.Anatomy&cell biology.2022

[5]蒙穎.盤狀結(jié)構(gòu)域受體1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究[D].蘭州大學(xué),2023.