背景^[1-3]

NPDC1抗體是一種可以特異性結(jié)合NPDC1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的NPDC1蛋白。NPDC1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

NPDC1，即細(xì)胞周期蛋白D1，別名包括BCL1、PRAD1、U21B31、D11S287E。NPDC1由人類NPDC1基因編碼，該基因位于11號(hào)染色體的q13.3區(qū)域。NPDC1是細(xì)胞周期中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其編碼的蛋白質(zhì)屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族，這些蛋白在細(xì)胞周期中的豐度具有顯著周期性。NPDC1與CDK4或CDK6形成復(fù)合物并作為其調(diào)節(jié)亞基，其活性對(duì)于細(xì)胞周期G1/S過渡是必需的。NPDC1與腫瘤抑制蛋白R(shí)b相互作用，并且這個(gè)基因的表達(dá)受到Rb的正向調(diào)控。NPDC1的突變、擴(kuò)增和過度表達(dá)會(huì)改變細(xì)胞周期的進(jìn)程，這在多種人類癌癥中經(jīng)常觀察到。NPDC1在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是多種癌癥治療的重要靶點(diǎn)。

NPDC1抗體

NPDC1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（NPDC1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(NPDC1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

NPDC1抗體可以用于NPDC1在伴有神經(jīng)浸潤(rùn)的結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

探索NPDC1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及臨床意義有可能為腫瘤研究提供新的思路與方法。

研究方法:1.篩選與結(jié)直腸癌神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)的基因并在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)平行驗(yàn)證通過ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)得到與神經(jīng)、突觸相關(guān)的基因集,結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出可能與神經(jīng)浸潤(rùn)、預(yù)后相關(guān)的基因,使用隨機(jī)森林的方法與之取交集定位目的基因NPDC1,進(jìn)一步通過Log2(TPM+0.01)配對(duì)T檢驗(yàn)、Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)、TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證NPDC1的表達(dá)情況。2.NPDC1基因功能分析使用Xena整理的TCGA-COAD數(shù)據(jù)進(jìn)行spearman相關(guān)性分析以研究NPDC1的基因功能,以|Rho>0.3|P<0.05的閾值把正負(fù)相關(guān)基因進(jìn)行GSEA、GSVA、GO、KEGG富集分析以尋找基因可能參與的信號(hào)通路。3.臨床驗(yàn)證NPDC1表達(dá)水平和分析臨床意義收集63例從2016年5月至2017年12在吉林大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)患者的石蠟標(biāo)本,以及10例2022年10月至2022年12月新鮮結(jié)直腸癌切除組織標(biāo)本。通過Rt-q PCR、NPDC1抗體WB和IHC分析NPDC1在結(jié)直腸正常組織、癌旁組織和癌組織中的表達(dá)情況,并分析NPDC1表達(dá)與臨床病理特征和生存預(yù)后之間的關(guān)系。

NPDC1抗體研究結(jié)果:1.NPDC1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)再結(jié)合TCGA-COAD樣本集通過單因素Cox回歸分析和Kaplan Meier plotter法聯(lián)合分析篩選出Cox-p Value與KM-p Value均小于0.05的13個(gè)基因:UNC5D、CHD5、SALL1、MANF、ADRA2B、DLX2、NTF4、PTPRD、NPDC1、LRRN4、NPAS1、SYN1、SYT8,最后與隨機(jī)森林真實(shí)重要性大于0.25的基因取交集后,最終得到NPDC1基因可能與結(jié)腸癌神經(jīng)浸潤(rùn)和生存預(yù)后精密關(guān)聯(lián)。并且通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)、TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步驗(yàn)證了NPDC1基因在結(jié)直腸癌中高表達(dá)。2.NPDC1基因功能分析基因相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)NPDC1與多種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、離子通道蛋白、信號(hào)通路受體明顯正相關(guān),與多種細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白呈負(fù)相關(guān),尤其與HMG20B具有很強(qiáng)相關(guān)性,HMG20B被認(rèn)為是細(xì)胞準(zhǔn)確進(jìn)入G2期和有絲分裂所必須的,提示NPDC1可能通過調(diào)控細(xì)胞周期從而調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。GO、KEGG、GSEA和GSVA分析發(fā)現(xiàn)NPDC1主要與一些細(xì)胞器調(diào)控和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的通路有關(guān),比如主要富集在線粒體調(diào)控、細(xì)胞遞送組裝調(diào)控、Notch信號(hào)通路、磷脂酶D信號(hào)通路、糖酵解、P53通路等信號(hào)通路。3.NPDC1在臨床組織中的表達(dá)驗(yàn)證Rt-q PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NPDC1 m RNA在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平高于正常組織,NPDC1抗體WB和IHC進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)直腸癌組織中NPDC1蛋白在表達(dá)水平高于正常組織和癌旁組織。并且NPDC1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌神經(jīng)浸潤(rùn)具有相關(guān)性(P<0.05),與性別、年齡、血管侵犯、TNM分期、CEA水平等沒有相關(guān)性(P>0.05)。

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