背景[1-3]
CCR1抗體是一種可以特異性結合CCR1的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CCR1蛋白。CCR1抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
CCR1基因編碼β趨化因子受體家族的一個成員，預計它是一個類似于G蛋白偶聯(lián)受體的七跨膜蛋白。該受體的配體包括巨噬細胞炎癥蛋白1α（MIP-1α），受正常T表達和分泌蛋白（RANTES）激活的調節(jié)，單核細胞趨化蛋白3（MCP-3）和髓系祖細胞抑制因子-1（MPIF-1）。趨化因子及其受體介導的信號轉導對于效應免疫細胞募集到炎癥部位至關重要。小鼠同源物的敲除研究表明，該基因在宿主保護免受炎癥反應以及對病毒和寄生蟲的易感性中的作用。發(fā)現(xiàn)該基因和其他趨化因子受體基因，包括CCR2、CCRL2、CCR3、CCR5和CCXCR1，在染色體3p上形成基因簇。
CCR1抗體
CCR1抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（CCR1抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CCR1抗體)。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
CCR1抗體可以用于德都紅花-7味散及木犀草素通過調控CCR1、DNMT1抑制肝纖維化的作用研究
闡明德都紅花-7味散及木犀草素通過調控CCR1、DNMT1抑制CCl4所致肝纖維化的影響。
方法:72只C57BL/6雄性小鼠,按體重隨機分為空白組、模型組、木犀草素低劑量組、木犀草素高劑量組、藍盆花組、德都紅花-7味散組,每組12只。除空白組外,其余組采用CCl4腹腔注射建立肝纖維化模型,其余組給予相應藥物灌胃4周,4周后取肝組織。CCR1抗體ELISA法檢測血清中相關含量,HE染色觀察肝組織的炎癥活動度,Masson染色評估肝組織膠原面積,Western blot檢測CCR1、DNMT1蛋白表達。
CCR1抗體結果:1.ELISA法:與模型組相比,各給藥組DNMT1、a-smA、III型前膠原的血清含量表達明顯減低,CCR1血清含量的表達明顯升高,具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。2.HE染色:模型組多個肝細胞體積明顯增大形態(tài)不規(guī)整,小葉結構紊亂、增生纖維條索交叉形成纖維間隔;各給藥組肝細胞體積有所增大,其余癥狀明顯輕于模型組。3.Masson染色:模型組中央靜脈周圍及匯管區(qū)膠原纖維增生,小葉結構紊亂,膠原纖維連接;各給藥組與模型組相比,可見少量藍染的膠原纖維。4.CCR1抗體Western blot法:與空白組比較模型組DNMT1、a-smA、CollagenⅠ表達顯著上調,CCR1表達降低,具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,與模型組比較,各給藥組DNMT1、a-smA、CollagenⅠ表達降低,CCR1升高,具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論:1.德都紅花-7味散、藍盆花、木犀草素減表達輕CCl4引起肝纖維化的保護作用,其通過CCR1、DNMT1、a-smA、CollagenⅠ蛋白,抑制或延緩肝纖維化。2.對肝癌表達的基因,在肝纖維化上發(fā)現(xiàn)DNMT1、CCR1的表達對診斷有意義,單成份、藥材與成藥對纖維化有顯著的調解作用,為進一步診療預防癌癥的發(fā)生,值得進一步研究。
參考文獻
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[5]韓格根套麗.德都紅花-7味散及木犀草素通過調控CCR1、DNMT1抑制肝纖維化的作用研究[D].內蒙古民族大學,2023.