背景[1-3]
CDCP1抗體是一種可以特異性結合CDCP1的人工合成抗體，可以靶向結合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的CDCP1蛋白。CDCP1抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。
CDCP1，也稱為CD318、TRASK和SIMA 135，是一種135-140 kDa的跨膜蛋白，在細胞外區(qū)域包含三個CUB結構域，在細胞質區(qū)域內包含一個六賴氨酸延伸。MW 80 kDa（p80）的可溶形式在N端側的未知位點被切割。CDCP1是造血干細胞的新型標志物。
CDCP1抗體
CDCP1抗體使用步驟（Western Blot）：
1.樣本制備
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。
2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白電泳
1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。
3.轉膜與封閉
1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5min。
2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。
3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
4.抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（CDCP1抗體按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(CDCP1抗體)。
3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。
7）顯影曝光。
應用[4][5]
CDCP1抗體可以用于CDCP1在肺癌的表達及RNA干擾對肺癌細胞生長的影響
在肺癌組織、細胞系、培養(yǎng)的肺癌干細胞CDCP1表達研究的基礎上,探討了CDCP1 RNA干擾對基因的抑制效應及對肺癌生長的影響,并初步從細胞凋亡方面探討了該基因在腫瘤發(fā)展中的作用。
(1) CDCPl在肺癌中的表達：為探討CDCP1在人類肺癌中的表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關性,通過CDCP1抗體免疫組化法檢測了肺腺癌、鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌中的表達,以正常肺組織、肺良性病變及癌前病變?yōu)閷φ?。CDCP1抗體結果顯示與正常肺組織、肺良性病變及癌前病變等對照組相比,肺癌組CDCP1表達顯著增加；CDCP1表達水平與肺癌病理學類型、淋巴結轉移顯著相關；CDCP1異常表達主要見于肺腺癌,而肺鱗癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌異常表達率低。通過CDCP1抗體細胞免疫化學、RT-PCR、免疫印記等方法在體外研究常用肺癌細胞株也得到相似結果,即肺腺癌細胞株A549、SPC-A-1中CDCP1表達水平較高,而小細胞肺癌細胞NCI-H-446表達水平較低。在證實CDCP1在肺癌異常表達研究的基礎上,為進一步探討其在肺癌干細胞的表達水平,我們首先在體外培養(yǎng)了肺癌十細胞,通過CDCP1抗體免疫細胞化學法初步檢測了CD133干細胞標志物,證明培養(yǎng)微球體的干細胞特性。在成功的4次培養(yǎng)物中均檢測到CDCP1的表達,但表達強度存在差異。提示CDCP1也過度表達于腫瘤干細胞。本實驗證實CDCP1在肺癌表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關。常用肺腺癌細胞株A549、SPC-A-1存在CDCP1過度表達,也過度表達于腫瘤干細胞。
(2)CDCP1RNA干擾抑制基因表達及影響肺癌細胞生長CDCP1 RNA干擾顯著抑制CDCP1基因的表達。CDCP1基因沉默的細胞增殖受到抑制；凋亡細胞顯著增加；細胞凋亡相關蛋白caspase表達顯著增加。提示CDCP1 RNA干擾顯著影響該基因表達,并通過促進細胞凋亡等機制有效抑制腫瘤的生長。通過本研究我們初步證實CDCP1主要在肺腺癌異常表達、并與腫瘤的發(fā)展相關；在肺癌干細胞中也存在高表達；干擾CDCP1基因有效抑制肺癌的生長,促進細胞凋亡。推測靶向CDCP1可能在腫瘤干細胞水平發(fā)揮作用。
參考文獻
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[3]Global Cancer Statistics,2002[J].D.MaxParkin;FreddieBray;J.Ferlay;PaolaPisani.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2009(2)
[4]Isolation of Multipotent Neural Crest‐Derived Stem Cells from the Adult Mouse Cornea[J].SatoruYoshida;ShigetoShimmura;NarihitoNagoshi;KeiichiFukuda;YumiMatsuzaki;HideyukiOkano;KazuoTsubota.STEM CELLS,2009(12)
[5]劉銳.CDCP1在肺癌的表達及RNA干擾對肺癌細胞生長的影響[D].吉林大學,2011.