背景^[1-3]

SAMHD1抗體是一種可以特異性結(jié)合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDX1蛋白。SAMHD1抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

SAMHD1在單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞中高度表達(dá)，在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中以較低程度高表達(dá)，據(jù)報(bào)道是一種HIV-1限制因子，可抑制HIV-1生命周期的早期步驟。Vpx（含有病毒蛋白X的病毒樣顆粒）可以通過(guò)與SAMHD1相互作用來(lái)克服這一阻斷，誘導(dǎo)SAMHD1的蛋白酶體依賴性降解。SAMHD1突變會(huì)導(dǎo)致Aicardi-Goutières綜合征，這是一種推測(cè)具有免疫發(fā)病機(jī)制的遺傳性腦病。已經(jīng)描述了編碼不同亞型的三種可變剪接轉(zhuǎn)錄本。

SAMHD1抗體

SAMHD1抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書(shū)，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（SAMHD1抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(SAMHD1抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

SAMHD1抗體可以用于SAMHD1單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用

以受捐者單核細(xì)胞提取的RNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法，擴(kuò)增出SAMHD1基因，通過(guò)雙酶切將其分別克隆至pcDNA3.1和pET30a載體中。通過(guò)對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化，最終獲得分子質(zhì)量約79KDa、可溶性形式的重組蛋白SAMHD1，并采用鎳柱對(duì)該蛋白進(jìn)行純化。SAMHD1抗體Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，原核及真核重組蛋白SAMHD1分別與His和HA抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明SAMHD1基因在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中均獲得正確表達(dá)。

本研究利用原核表達(dá)并純化的人SAMHD1蛋白為免疫原，經(jīng)腹腔接種4周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得了1株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3C3。其抗體亞型為IgG2b/κ鏈。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3C3MAb不僅可以識(shí)別pcDNA-huSAMHD1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后大量表達(dá)的外源性SAMHD1，也可以識(shí)別293T、THP-1細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的少量SAMHD1蛋白。此單抗不與猴、馬SAMHD1的真核表達(dá)蛋白反應(yīng)，且與未轉(zhuǎn)染的馬皮細(xì)胞、驢皮細(xì)胞、兔腎細(xì)胞均無(wú)反應(yīng)。表明制備的3C3MAb僅具有識(shí)別人SAMHD1的特點(diǎn)，而與其他種屬的SAMHD1無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的種屬特異性。SAMHD1抗體單抗可用于免疫熒光、Western blot、ELISA等免疫學(xué)方法的檢測(cè)。HD結(jié)構(gòu)域是SAMHD1的主要功能區(qū)，為鑒別制備的3C3MAb針對(duì)的抗原表位是否也位于其HD區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了SAMHD1的兩個(gè)功能區(qū)SAM、HD的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-SAMHD1-SAM和pET-SAMHD1-HD，分別將其轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。兩個(gè)重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為26kDa和62kDa。Western blot結(jié)果表明3C3MAb只與SAMHD1的HD原核表達(dá)蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與其SAM原核表達(dá)蛋白無(wú)反應(yīng)，因此，3C3MAb針對(duì)的抗原表位位于HD區(qū)域內(nèi)。

參考文獻(xiàn)

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