背景^[1-3]

USP14抗體是一種可以特異性結(jié)合PDX1的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的PDX1蛋白。USP14抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

USP14（泛素羧基末端水解酶14）也稱為TGT，屬于肽酶C19家族。哺乳動(dòng)物USP14在已知的UBP酶中是獨(dú)一無二的，因?yàn)樗谂c26S蛋白酶體特異性結(jié)合時(shí)被催化激活。USP14抑制加速了氧化蛋白的降解并增強(qiáng)了對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力。該蛋白質(zhì)具有45 kDa催化結(jié)構(gòu)域（PMID：16211010）。

USP14抗體

USP14抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（USP14抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(USP14抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

USP14抗體可以用于線粒體乙醛脫氫酶2通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展

ALDH2通過4-HNE調(diào)節(jié)cGAS去泛素化來調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ox-LDL刺激后內(nèi)源性cGAS K48-linked泛素化水平降低,而ALDA-1顯著增強(qiáng)了ox-LDL刺激后cGAS K48-linked泛素化;而daidzin對(duì)ALDH2的抑制進(jìn)一步降低了ox-LDL刺激后的cGAS k48-linked的泛素化。已經(jīng)證實(shí),ALDH2代表性底物4-HNE水平的增加可以通過加合作用改變蛋白質(zhì)翻譯后修飾,并有助于AS的發(fā)生和發(fā)展。因此,我們推測(cè)4-HNE調(diào)控去泛素化酶裂解cGAS的K48-linked多泛素鏈,導(dǎo)致cGAS蛋白的穩(wěn)定。通過Co-IP對(duì)可能參與調(diào)控cGAS k48-linked泛素化的去泛素化酶進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性cGAS與USP14形成了一個(gè)復(fù)合物;并且這種相互作用在4-HNE刺激后增強(qiáng)了。

我們使用USP14抗體進(jìn)行Co-IP,通過USP14抗體Western blot檢測(cè)cGAS與USP14的結(jié)合情況,進(jìn)一步證明了cGAS和USP14之間的內(nèi)源性相互作用。為了驗(yàn)證USP14對(duì)4-HNE刺激后cGAS泛素化的影響,我們使用HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了標(biāo)記為Flag的cGAS、Myc標(biāo)記的K48-Ub和HA標(biāo)記的USP14質(zhì)粒(野生型或突變體(C1 14A))。正如預(yù)期的那樣,USP14(WT)過表達(dá)情況下,4-HNE刺激后cGAS K48-linked的泛素化水平明顯下調(diào),而USP14(C114A)則無上述泛素化水平的變化。我們接下來檢測(cè)了USP14是否也介導(dǎo)了ALDH2/4-HNE對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。Western blot分析顯示,抑制USP14顯著減弱了4-HNE或ALDH2下調(diào)對(duì)巨噬細(xì)胞M1型極化的促進(jìn)作用。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明4-HNE通過增強(qiáng)USP14-cGAS的相互作用,抑制了cGAS的K48多泛素化依賴的蛋白降解,穩(wěn)定cGAS蛋白水平。Amlexanox可減輕ALDH2活性下調(diào)對(duì)HFD喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和巨噬細(xì)胞極化的影響在ApoE-/-小鼠進(jìn)行NC或HFD喂養(yǎng),構(gòu)建模型期間,小鼠每隔一天腹腔注射daidzin,給予或不給予Amlexanox,發(fā)現(xiàn)Amlexanox可顯著抑制TBK1及其下游分子的活化,減少了HFD和daidzin聯(lián)合作用下的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的斑塊面積、降低了炎癥因子水平,降低了M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CXCL-10和iNOS)的表達(dá),增加了M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(Arg1)的表達(dá)。

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