背景^[1-3]

HSL抗體是一種可以特異性結(jié)合HSL的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的HSL蛋白。HSL抗體可用于多種科學應用，包括Western Blot、免疫組織化學、免疫細胞化學、免疫沉淀和ELISA。

LIPE，也稱為HSL和LHS，屬于“GDXG”脂肪分解酶家族。在脂肪組織和心臟中，它主要將儲存的甘油三酯水解為游離脂肪酸，而在類固醇生成組織中，它主要將膽固醇酯轉(zhuǎn)化為游離膽固醇以產(chǎn)生類固醇激素。LIPE有兩種亞型，分子量分別為117 kDa和84 kDa。

HSL抗體

HSL抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預制膠，將預制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（HSL抗體按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(HSL抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應用^[4][5]

HSL抗體可以用于Grb14通過HSL促進肝臟細胞脂肪分解的作用機理

甘油三酯(TG)作為動物體內(nèi)脂肪最主要的貯存形式之一,在機體缺乏外界能量供給或需要脂肪分解提供能量時,TG在脂肪酶如脂肪甘油三酯酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、單?；视椭久?MGL)等作用下釋放出游離的脂肪酸(FA)和甘油。脂解代謝除了受這些分解酶的調(diào)控,還受各種生長因子、激素、轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控,當這些過程出現(xiàn)異常時,機體可能會產(chǎn)生各種病癥如:肥胖癥、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、高胰島素血癥以及癌癥等。生長因子受體結(jié)合蛋白14(Grb14)是一種接頭蛋白,既往研究表明Grb14通過特異性地抑制胰島素受體酪氨酸激酶的活性調(diào)控葡糖代謝,然而Grb14在脂肪分解代謝中的作用暫不清楚。因此,本研究通過免疫熒光、免疫沉淀、甘油三酯及甘油含量的測定、體外蛋白純化、實時熒光定量PCR等分子生物學方法分別在蛋白水平及RNA水平探究Grb14在脂肪分解代謝中的作用,旨在揭示Grb14在調(diào)控脂肪分解代謝中具體的作用機理。

主要結(jié)論如下:(1)Grb14促進肝臟細胞的脂肪分解。在人源肝臟細胞HL-7702中過表達Grb14測定細胞中甘油三酯含量以及培養(yǎng)液中甘油的釋放量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):表達Grb14的細胞中甘油三酯含量較對照組顯著下調(diào),甘油的釋放量上升。其次在He La細胞中過表達Grb14檢測脂滴的變化,免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn):表達Grb14的細胞中脂滴的數(shù)目較對照組明顯減少。因此推測Grb14的高表達,促進細胞中脂肪的分解。(2)Grb14與HSL協(xié)同促進肝臟細胞的脂肪分解。HSL作為最先發(fā)現(xiàn)的脂肪酶,既往研究表明它參與甘油三酯、甘油二酯及膽固醇酯的水解。HSL抗體試驗發(fā)現(xiàn)Grb14的N端與HSL的N端有相互作用,通過對肝細胞中積累的甘油三酯及培養(yǎng)基中釋放的甘油含量的測定,發(fā)現(xiàn)Grb14與HSL協(xié)同促進細胞中甘油三酯的水解。

HSL抗體免疫熒光試驗得到相同的結(jié)果,單表達Grb14或HSL的細胞,脂滴含量明顯減少,而共表達Grb14與HSL的細胞中,脂滴幾乎完全消失。在HL-7702細胞中過表達Grb14發(fā)現(xiàn),脂肪分解相關(guān)基因如ATGL,HSL、CGI-58、ADRB、ACOX和LPL在m RNA水平顯著上調(diào);敲低Grb14,大多數(shù)脂肪分解相關(guān)基因的表達顯著下調(diào)。結(jié)果顯示:無論在RNA水平還是在蛋白質(zhì)水平,Grb14都促進肝臟細胞的脂肪分解。(3)Grb14通過調(diào)控HSL的水解酶活性與肝臟細胞的自噬促進脂肪的分解。試驗結(jié)果顯示Grb14能直接影響PKA介導的HSL的磷酸化,調(diào)控HSL介導的脂滴的水解;同時,Grb14通過影響自噬標記蛋白的含量及自噬底物的積累促進肝細胞中的脂噬,為肝細胞中脂滴的分解提供新的思路。綜上所述,Grb14作為肝細胞中HSL的上游元件,一個新的信號節(jié)點調(diào)控脂解代謝,同時也為脂肪代謝類疾病的藥物開發(fā)提供新思路。

參考文獻

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[4]Lipophagy-derived fatty acids undergo extracellular efflux via lysosomal exocytosis.[J].Cui Wenqi;;Sathyanarayan Aishwarya;;Lopresti Michael;;Aghajan Mariam;;Chen Chi;;Mashek Douglas G.Autophagy.2020

[5]瞿敏.Grb14通過HSL促進肝臟細胞脂肪分解的作用機理[D].安徽大學,2021.