背景^[1-3]

NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞源自一名55歲白人女性肺腺癌患者，患者有15年吸煙史，每年吸煙15包。NCI-H1395細(xì)胞系于1986年4月建立。NCI-H1395細(xì)胞表現(xiàn)為上皮樣形態(tài)，貼壁生長。

除了NCI-H1395細(xì)胞系外，還有一株名為NCI-BL1395[BL1395]的細(xì)胞系，來源于同一患者的類淋巴母細(xì)胞。該患者可能同時患有與淋巴系統(tǒng)相關(guān)的疾病。

NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞

NCI-H1395細(xì)胞特性：

上皮細(xì)胞樣：NCI-H1395細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞的形態(tài)特征；

貼壁生長：這些細(xì)胞是貼壁生長型，會附著在培養(yǎng)容器表面生長；

NCI-BL1395是另一株來源于同一患者的類淋巴母細(xì)胞。

NCI-H1395細(xì)胞傳代步驟：

當(dāng)NCI-H1395細(xì)胞生長至80-90%匯合度時進(jìn)行傳代。

1.吸出舊培養(yǎng)基。

2.用PBS輕輕沖洗NCI-H1395細(xì)胞1-2次，以去除殘留血清。

3.加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C孵育2-3分鐘。

4.輕輕拍打培養(yǎng)瓶，觀察NCI-H1395細(xì)胞是否脫落。

5.加入含血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

6.將NCI-H1395細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1000rpm離心5分鐘。

7.棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸NCI-H1395細(xì)胞。

8.按1:3或1:4的比例將NCI-H1395細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中。

NCI-H1395細(xì)胞凍存

凍存液配方：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO

將NCI-H1395細(xì)胞懸浮在凍存液中，緩慢降溫后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

NCI-H1395細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取出NCI-H1395細(xì)胞，在37°C水浴中快速解凍。

將NCI-H1395細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含預(yù)熱完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。

24小時后更換新鮮培養(yǎng)基，去除DMSO。

注意事項(xiàng)

無菌操作：所有操作需在無菌條件下進(jìn)行，避免細(xì)菌、真菌等微生物污染。

培養(yǎng)基選擇：使用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%FBS和1%P/S。

培養(yǎng)基成分：特定實(shí)驗(yàn)條件下，可能需要添加特定的細(xì)胞因子或添加物。

細(xì)胞來源信息：了解NCI-H1395細(xì)胞的來源背景有助于研究結(jié)果的解釋。

質(zhì)量控制：定期進(jìn)行支原體檢測，每3-4個月進(jìn)行一次STR鑒定，確保NCI-H1395細(xì)胞系的真實(shí)性和純度。

培養(yǎng)過程監(jiān)控：定期觀察NCI-H1395細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)并解決培養(yǎng)過程中的問題。

應(yīng)用^[4][5]

NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞可以用于肺癌細(xì)胞來源的外泌體中microRNA差異性分析

通過對不同類型肺癌細(xì)胞和正常肺上皮細(xì)胞分泌外泌體中micro RNA的提取,統(tǒng)計(jì)分析得到差異性的micro RNA,從而篩查出外泌體與肺癌的診斷和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性的micro RNA,擬為肺癌的臨床診斷與治療提供以micro RNA為代表的分子標(biāo)記物。

方法:從中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心購買三種肺癌細(xì)胞95D(人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞)、HCC827(人非小細(xì)胞癌)、NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞以及HBE(正常肺上皮細(xì)胞)。然后對不同類型肺癌細(xì)胞及正常細(xì)胞進(jìn)行離心后貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞,肺癌細(xì)胞培養(yǎng)儀器和設(shè)備為美國Gibco公司的RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(10%)、雙抗(青霉素和鏈霉素)(1%)、Sigma公司的0.25%胰酶-0.02%EDTA和日本SANYO公司MCO-20AIC二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱;正常細(xì)胞培養(yǎng)儀器和設(shè)備為美國Gibco公司的DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(10%)、雙抗(青霉素和鏈霉素)(1%)、Sigma公司的0.25%胰酶-0.02%EDTA和日本SANYO公司MCO-20AIC二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。

NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法如下:吸出舊的培養(yǎng);PBS沖洗2次,每次2ml;消化:用1ml0.25%胰酶-0.02%EDTA進(jìn)行消化;終止消化:加入4ml培養(yǎng)基終止消化;吹打;1000g5min離心;棄上清,加新的培養(yǎng)基,分別接種于新的培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞傳代培養(yǎng)后收集不同類型細(xì)胞培養(yǎng)基,保證收集過程無菌無污染,將收集到的條件培養(yǎng)基凍存于-80℃冰箱(<1個月),當(dāng)收集至500ml時,統(tǒng)一解凍(4℃下)。接著進(jìn)行超速離心法分離提取外泌體,方法如下:在2000g的離心力條件下持續(xù)離心20min,留上清;在10000g的離心力條件下持續(xù)離心30min,留上清;用0.22μm的濾膜進(jìn)行超濾;再在100000g的離心力條件下持續(xù)離心70min,棄上清;用PBS對每只離心管沉淀進(jìn)行重懸后,集中于一只離心管中,補(bǔ)足PBS后再次離心。濾紙吸出殘留管壁的PBS后,用200ul的PBS對沉淀進(jìn)行重懸(殘留約50ul液體)。最后對外泌體濃度用bca試劑盒進(jìn)行測定,用RNA質(zhì)檢、加poly(A)尾、生物素標(biāo)記、雜交、洗染和掃描等方法基因芯片處理micro RNA,以對比基因之間的差異性。結(jié)果:透射電鏡觀察到超速離心后的溶液富含直徑30-100nm的囊泡結(jié)構(gòu),最小直徑38nm,最大直徑100nm,總體直徑平均值95%的可信區(qū)間為(72.613±3.845nm)。經(jīng)提取外泌體中的micro RNA,對比三種肺癌細(xì)胞外泌體與正常肺上皮細(xì)胞外泌體中的micro RNA成分差異。

結(jié)果如下:HCC827(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞-腺癌)與HBE(正常肺上皮細(xì)胞)相比,上調(diào)micro RNA數(shù)為36,下調(diào)micro RNA數(shù)為26,95D(人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞)與HBE(正常肺上皮細(xì)胞)相比,上調(diào)micro RNA數(shù)為60,下調(diào)micro RNA數(shù)為22;NCI-H1395人肺腺癌細(xì)胞與HBE(正常肺上皮細(xì)胞)相比,上調(diào)micro RNA數(shù)為295,下調(diào)micro RNA數(shù)為25。三種肺癌細(xì)胞外泌體中micro RNA對比正常細(xì)胞均有上調(diào)10倍以上的micro RNA共有3種,分別是hsa-mi R-3960,hsa-mi R-6729-5p,hsa-mi R-6090;對比正常細(xì)胞均有上調(diào)5倍以上的micro RNA共有4種,分別是hsa-mi R-6803-5p,hsa-mi R-6087,hsa-mi R-638,hsa-mi R-6089;對比正常細(xì)胞均有下調(diào)10倍以上的micro RNA有1種,是hsa-mi R-155-5p。

參考文獻(xiàn)

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