背景[1-6]
Western blot檢測服務(wù)主要是利用電泳技術(shù)（SDS-PAGE）區(qū)分不同大小的蛋白，然后轉(zhuǎn)移至固相支持物（PVDF膜，NC膜等）上，再根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合原理，通過化學(xué)發(fā)光或呈色等技術(shù)檢測蛋白的表達(dá)。Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，一抗再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
Western Blot實(shí)驗(yàn)流程
1、蛋白質(zhì)抽提
A、實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白。
B、實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。
2、蛋白質(zhì)定量
按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)
將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)個孔中，電泳分離蛋白。
4、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜
5、膜的封閉和抗體孵育
A、膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。
B、封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。
C、加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。
6、結(jié)果檢測
化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7、數(shù)據(jù)分析
目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
8、提供實(shí)驗(yàn)報告
包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
應(yīng)用[7][8]
Western blot檢測服務(wù)可用于研究蛋白信號通路與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系：
卵巢癌是世界范圍內(nèi)最致命的婦科惡性疾病之一,由于缺乏典型的臨床癥狀、特異的體征及腫瘤標(biāo)志物等有效的篩查手段,絕大多數(shù)卵巢癌病人在得到診斷時已處于晚期,使其死亡率高居婦科惡性腫瘤首位。腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有賴于細(xì)胞的遷移與侵襲,然而決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制目前仍然不十分清楚。因此,努力探索調(diào)控卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的分子靶標(biāo)將至關(guān)重要。
Hedgehog(Hh)信號通路在細(xì)胞命運(yùn)決定以及細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。該通路由Hh配體,膜受體Ptch和跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smo以及參與Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞漿蛋白復(fù)合體組成,其級聯(lián)傳導(dǎo)的末點(diǎn)被公認(rèn)為鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli(Glioma-associated oncogene transcription factors),是該信號通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起樞紐作用。Hh靶基因涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期以及干細(xì)胞形成和細(xì)胞侵襲等多方面。通過Western-blot及real-time PCR等方法檢測卵巢癌及正常卵巢組織中Hh信號通路重要組分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表達(dá)情況。
采用real-time PCR和Western blot在mRNA以及蛋白水平驗(yàn)證芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)經(jīng)GANT61處理的SKO-V3細(xì)胞,ITGB4,COL1A1,COL5A1等基因mRNA水平表達(dá)明顯下降,(p<0.01)；而LAMC2,ITGA5,LAMA3等基因mRNA水平表達(dá)明顯升高,(p<0.01),與Microarray所獲結(jié)果一致。此外,CD24,CD70,S100A2及MMP7等mRNA表達(dá)水平下降,(p<0.01);而S100A4和FAK mRNA水平無顯著差異,(p>0.05),與Microarray所獲結(jié)果基本一致；Western blot結(jié)果顯示：GANT61處理的SKO-V3細(xì)胞,ITGB4,CD24,MMP7等蛋白表達(dá)水平明顯下降,(p<0.01)；而FAK蛋白表達(dá)水平改變不明顯,(p>0.05),與real-time PCR結(jié)果基本一致。采用Shh配體條件培養(yǎng)液(Shh-Med)激活Hh信號通路,觀察上述差異基因的表達(dá)變化
參考文獻(xiàn)
[1]Gastric cancer(GC)patients with hedgehog pathway activation:PTCH1 and GLI2 as independent prognostic factors[J].Su Jin Lee,In-Gu Do,Jeeyun Lee,Kyoung-Mee Kim,Jiryeon Jang,Insuk Sohn,Won Ki Kang.Targeted Oncology.2013(4)
[2]STAT3 interacts with Skp2/p27/p21 pathway to regulate the motility and invasion of gastric cancer cells[J].Zheng Wei,Xian Jiang,Haiquan Qiao,Bo Zhai,Lianfeng Zhang,Qiang Zhang,Yuanhong Wu,Hongchi Jiang,Xueying Sun.Cellular Signalling.2013(4)
[3]The hedgehog pathway in breast cancer[J].Sheikh Asim Ali.Chinese Journal of Cancer Research.2012(4)
[4]Efficient inhibition of intraperitoneal ovarian cancer growth in nude mice by liposomal delivery of short hairpin RNA against STAT 3[J].Qingyuan Jiang,Lei Dai,Lin Cheng,Xiaolei Chen,Yiming Li,Shuang Zhang,Xiaolan Su,Xia Zhao,Yuquan Wei,Hongxin Deng.J Obstet Gynaecol Res.2012(3)
[5]Integrated Hedgehog signaling is induced following castration in human and murine prostate cancers[J].Eleni Efstathiou,Maria Karlou,Sijin Wen,Anh Hoang,Curtis A.Pettaway,Louis L.Pisters,Sankar Maity,Patricia Troncoso,Christopher J.Logothetis.Prostate.2012(2)
[6]EGFR mediates LPA-induced proteolytic enzyme expression and ovarian cancer invasion:Inhibition by resveratrol[J].Kang Jin Jeong,Kyung Hwa Cho,Nattapon Panupinthu,Hoon Kim,Jaeku Kang,Chang Gyo Park,Gordon B.Mills,Hoi Young Lee.Molecular Oncology.2012
[7]BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles[J].Kellie Duench,Tamara A.Franz-Odendaal.Developmental Biology.2012(1)
[8]陳琦.Hedgehog信號通路與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究[D].南昌大學(xué),2013.