背景^[1-3]

大鼠腎系膜細(xì)胞是從大鼠的腎小球組織中分離出來的細(xì)胞。這些細(xì)胞在腎臟中起著重要的作用，它們位于腎小球的中軸區(qū)，分布于毛細(xì)血管簇中的毛細(xì)血管之間。大鼠腎小球系膜細(xì)胞的主要功能包括維持腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的完整性，調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過率，以及分泌多種細(xì)胞生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板源性生長因子以及腎素等生物活性物質(zhì)，從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。

在細(xì)胞培養(yǎng)方面，大鼠腎小球系膜細(xì)胞通常使用DMEM培養(yǎng)基，并添加10%胎牛血清和1%雙抗（包括青霉素和鏈霉素）。培養(yǎng)條件為37攝氏度、5%二氧化碳和飽和濕度。細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)上皮細(xì)胞樣。

大鼠腎系膜細(xì)胞

大鼠腎系膜細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠腎系膜細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠腎系膜細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠腎系膜細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

大鼠腎系膜細(xì)胞可以用于腎安Ⅰ號對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1、HGF表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

通過對大鼠腎系膜細(xì)胞的體外培養(yǎng),觀察腎安Ⅰ號對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及TGF-β1和HGF表達(dá)的影響,進(jìn)而探討其阻緩腎纖維化的可能作用機(jī)制。

方法:1.應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),進(jìn)行大鼠腎系膜細(xì)胞培養(yǎng),并選擇脂多糖為刺激物。

2. 在體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞中,按不同分組:①正常組（普通培養(yǎng)液）;②LPS組（含LPS的培養(yǎng)液）;③腎安組（含腎安Ⅰ號的培養(yǎng)液）,分別加入不同培養(yǎng)液,于培養(yǎng)24小時和48小時后在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)觀察。

3.用臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法測含不同濃度腎安Ⅰ號培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞活力,觀察腎安Ⅰ號對大鼠腎系膜細(xì)胞的毒性作用,從而確定實(shí)驗(yàn)用含腎安Ⅰ號培養(yǎng)液的合理濃度。

4.在體外培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞胞中,按不同分組:①空白組,即GMC組（普通培養(yǎng)液）;②對照組,即LPS組（含LPS的培養(yǎng)液）;③腎安低劑量組（含低濃度腎安Ⅰ號的培養(yǎng)液）;④腎安中劑量組（含中等濃度腎安Ⅰ號的培養(yǎng)液）;⑤腎安高劑量組（含高濃度腎安Ⅰ號的培養(yǎng)液）,分別加入受試品,采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法,于24小時、48小時和72小時觀察各組標(biāo)本中大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖水平,進(jìn)而選擇藥物作用的最佳濃度及時間段。5.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中,按不同分組:①空白組,即GMC組（普通培養(yǎng)液）;②對照組,即LPS組（含LPS的培養(yǎng)液）;③治療組,即腎安組（含腎安Ⅰ號的培養(yǎng)液）,分別加入受試品,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)法觀察各組標(biāo)本中大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)TGF-β1和HGF的情況。

結(jié)果:1.大鼠腎系膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)傳代培養(yǎng)后的大鼠腎小球系膜細(xì)胞,一般24小時全部貼壁,純度極高,生長迅速,很快融合成片,密集時可重疊生長,2-3天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)成功且符合實(shí)驗(yàn)要求。

2. 大鼠腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在倒置顯微鏡下觀察,可見正常組大鼠腎小球系膜細(xì)胞體積較大,且純度極高,形態(tài)多為梭形或星形。經(jīng)HE染色后,位相顯微鏡下見細(xì)胞結(jié)構(gòu)十分清晰,胞漿內(nèi)可見大量微絲樣結(jié)構(gòu),核居中央,多呈圓形或橢圓形,核周胞質(zhì)散布大量的細(xì)胞小顆粒。與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。經(jīng)LPS處理24小時后,光鏡下可見LPS組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生明顯,細(xì)胞體積增大,但附壁能力弱,易脫落,相鄰細(xì)胞間連接性有所降低。48小時后大鼠腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞體積有所縮小,形態(tài)變圓,核固縮開始出現(xiàn),核顏色加深,折光性增強(qiáng)。澎磚尹硬夢陀叨士矛斌必丈而經(jīng)中藥腎安I號處理的腎安組大鼠腎小球系膜細(xì)胞貼壁生長良好,幾乎無脫落,胞漿飽滿,相鄰細(xì)胞生長融合成片。形態(tài)學(xué)觀察與正常組一致。

3.大鼠腎系膜細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)臺盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)顯示:腎安I號25%,12.5%和6.25W0濃度組24小時,48小時和72小時細(xì)胞活力均達(dá)90%以上。經(jīng)XZ檢驗(yàn),腎安I號上述三組細(xì)胞活力與空白組比較,無顯著性差異（P>0.05）。

參考文獻(xiàn)

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