背景^[1-3]

IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞是一種廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的細(xì)胞模型。這些細(xì)胞源自16周齡女性胎兒的正常肺組織，具有特定的生物學(xué)特性，如能夠合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白等。這些特性使得IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞成為研究肺部細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程的重要工具，對(duì)于肺部疾病的治療和預(yù)防具有重要意義。

在細(xì)胞培養(yǎng)方面，IMR-90細(xì)胞系在細(xì)胞衰老前可以達(dá)到約58次的群體倍增。它們?cè)隗w外以成纖維狀形態(tài)貼壁生長，表現(xiàn)出許多已分化平滑肌細(xì)胞的特征，如肌動(dòng)蛋白附著位點(diǎn)呈顯著規(guī)則的縱向排列。此外，這些細(xì)胞對(duì)多種病毒具有敏感性，包括人類脊髓灰質(zhì)炎病毒1型、2型和3型，水痘-帶狀皰疹病毒，單純皰疹病毒1型和2型，牛痘病毒，人類皰疹病毒5型，以及水泡性口炎病毒。

IMR-90細(xì)胞的培養(yǎng)條件包括MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10-20%FBS、1%非必需氨基酸和1%雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為溫度37°C、氣相95%空氣和5%CO2、濕度70-80%。傳代密度為70-80%，比例為1:2-1:8，換液周期為每2-3天。凍存液配方為90%完全培養(yǎng)基和10%DMSO，凍存后的細(xì)胞可以在液氮中長期保存。

IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞

IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞可以用于EGF誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制研究

研究發(fā)現(xiàn)EGF能夠誘導(dǎo)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老,所以本課題主要對(duì)EGF誘導(dǎo)IMR90細(xì)胞衰老的機(jī)制進(jìn)行了探究。

研究方法與結(jié)果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)EGF能夠誘導(dǎo)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老。首先,細(xì)胞生長曲線和Brd U摻入實(shí)驗(yàn)證明了EGF處理抑制了IMR90細(xì)胞的生長。通過觀察,發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGF處理的細(xì)胞呈現(xiàn)出衰老細(xì)胞的表征,SA-β-gal染色和DAPI染色的結(jié)果表明EGF誘導(dǎo)IMR90細(xì)胞發(fā)生了衰老。在此基礎(chǔ)上,免疫熒光和免疫印跡技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示,53BP1凝集點(diǎn)形成,γH2A.X和53BP1蛋白水平上調(diào),表明EGF處理引發(fā)了DNA損傷反應(yīng);p38、p-p38、p53、p-p53、p21和p16蛋白水平上調(diào),表明EGF激活了衰老相關(guān)信號(hào)通路。在探究EGF誘導(dǎo)IMR90細(xì)胞衰老的機(jī)制的過程中,Ras-GTP assay和免疫印跡的結(jié)果表明EGF刺激之后,細(xì)胞內(nèi)的Ras-GTP、p-ERK1/2蛋白水平上調(diào),EGF激活了細(xì)胞內(nèi)的Ras信號(hào)通路;利用慢病毒敲減BRaf抑制了EGF引起的細(xì)胞衰老。

因此,推測(cè)EGF是通過激活Ras-Raf-MEK-ERK通路誘導(dǎo)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老的。此外,還發(fā)現(xiàn)EGF誘導(dǎo)IMR-90人胚肺成纖維細(xì)胞衰老與細(xì)胞周期相關(guān),處于G2/M期的細(xì)胞更容易被EGF誘導(dǎo)發(fā)生衰老。研究結(jié)論與意義:綜合以上研究內(nèi)容,發(fā)現(xiàn)EGF通過激活EGFR下游的Ras信號(hào)通路,引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷反應(yīng)和衰老相關(guān)信號(hào)通路的激活,導(dǎo)致IMR90細(xì)胞的衰老。這些研究成果豐富了人們對(duì)EGF生物學(xué)功能的認(rèn)知,有助于推動(dòng)EGF誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的機(jī)制的研究。

參考文獻(xiàn)

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