背景^[1-3]

血清封閉劑是免疫學(xué)實驗中常用的一種試劑，主要用于減少或消除非特異性結(jié)合背景的影響。常見的封閉劑包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）、動物血清和Fab片段單鏈二抗等。這些封閉劑的作用是封閉固相載體上的未結(jié)合位點，從而減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點的非特異性結(jié)合。

脫脂奶粉：便宜且適用范圍較窄。由于成分復(fù)雜，可能含有生物素、堿性磷酸酶，不適合用于磷酸化蛋白檢測和生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。

牛血清白蛋白（BSA）：成分單一，適用于大多數(shù)情況。BSA可能含有少量的抗體殘留，可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)。建議使用不含IgG的BSA產(chǎn)品。

動物血清：封閉血清主要用于免疫組化（IHC）或免疫熒光（IF）實驗中樣本的封閉，以降低背景和減少假陽性。血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合，從而減少背景。

Fab片段單鏈二抗：也常用于免疫學(xué)實驗中的封閉。

在選擇封閉劑時，應(yīng)考慮實驗的具體要求，如特異性、背景信號、成本等因素。例如，在ELISA實驗中，常用5%脫脂奶粉或BSA封閉膜上除轉(zhuǎn)印蛋白占據(jù)的其它部位；在Western Blotting實驗中，為減少非特異性條帶，可在用一抗孵育前使用適當(dāng)?shù)淖钄嘣噭┳钄嗄ぁ?/p>

血清封閉劑

定義與來源

定義：血清封閉劑是將養(yǎng)殖的非免疫的正常動物采血后，不加抗凝劑使血液凝固，血塊收縮析出的淡黃色液體，經(jīng)過特殊工藝處理而成。它特別適用于各類免疫學(xué)實驗中的封閉處理。

來源：通常來源于牛、羊、兔等非免疫的正常動物。

血清封閉劑作用機制

封閉劑能夠占據(jù)樣本中的“黏性”位點，如暴露的帶電性或疏水性蛋白表面，從而阻止一抗和二抗與非靶標(biāo)位點的非特異性結(jié)合。

它還可以封閉樣品中內(nèi)源性的Fc片段結(jié)合位點，阻斷抗體與樣品中的Fc受體結(jié)合，進而降低背景信號，減少假陽性結(jié)果。

血清封閉劑應(yīng)用場景

血清封閉劑在免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）等實驗中廣泛應(yīng)用，用于封閉樣本中的非特異性結(jié)合位點。

它也適用于ELISA等其他免疫學(xué)實驗，以提高實驗的特異性和靈敏度。

血清封閉劑使用方法

血清封閉劑通常以液體形式提供（原液），無需溶解，可直接用PBS等緩沖液稀釋后使用。

在實驗過程中，根據(jù)實驗需求將適量封閉劑加入到樣本中，進行一定時間的孵育即可。

血清封閉劑儲存與穩(wěn)定性

血清封閉劑應(yīng)儲存在適當(dāng)?shù)臏囟认拢L時間儲存在2～8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。因此，推薦在-20℃以下儲存血清，并避免反復(fù)凍融。

如果開蓋后未使用完，建議存放于4℃，但請勿超過一個月。

應(yīng)用^[4][5]

血清封閉劑可以用于胃蛋白酶在喉癌中的表達及作用

利用熒光定量PCR和Western Blotting技術(shù)檢測喉癌細胞在Pepsin刺激后多個上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的變化情況,從而證實Pepsin是否誘導(dǎo)喉癌細胞發(fā)生EMT,為深入理解咽喉反流是否參與喉癌發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法1.臨床標(biāo)本收集18例聲帶白斑組織和21例喉癌組織均取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院因聲帶白斑及喉癌(T1-3N1M0)擬行手術(shù)治療的患者,手術(shù)中取喉病變組織標(biāo)本,所有患者均尚未接受放化療治療。16例健康喉上皮組織在南方醫(yī)院耳鼻喉科門診表麻纖維電子喉鏡下取聲帶近室?guī)幱坞x緣處組織,所有受試者要求檢查前2周內(nèi)無服用質(zhì)子泵抑制劑、促胃腸動力藥物。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者及健康志愿者均自愿加入且簽署參與研究的知情同意書。2.24小時多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測：采用ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測便攜系統(tǒng)(Sandhill scientific inc,美國)及型號ZAI-BL-48E單根分叉型電極,電極直徑2.3 mm,共有6個阻抗通道,分別位于LES上方3 cm、5 Cm、7 cm、9 cm以及UES下方3 cm、5 cm；2個pH監(jiān)測位點分別位于LES上方5 cm和UES上方1 cm。監(jiān)測電極使用前均行pH 4.0和pH 7.0校準(zhǔn)液定標(biāo)校準(zhǔn)。監(jiān)測前患者禁食水至少8 h,取臥位,經(jīng)鼻插入監(jiān)測導(dǎo)管,根據(jù)食管動力監(jiān)測定位LES位置,胸前固定外置參考電極。調(diào)整ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測便攜系統(tǒng)開始記錄咽喉反流及胃食管反流數(shù)據(jù)。告知患者注意事項,囑其次日同一時間返回檢查室(保證檢查時間大約24 h),拆除儀器,結(jié)束檢查。監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)處理采用Bioview反流分析軟件(Sandhill Scientific),輸出反流波形圖和反流數(shù)據(jù)報告。24小時多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測結(jié)果判讀：咽喉酸反流次數(shù)≥2次為咽喉反流陽性標(biāo)準(zhǔn),DeMeester≥14.7分為胃食管反流陽性標(biāo)準(zhǔn)。3.免疫組化將石蠟切片進行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉劑封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進行,免疫組化的檢測結(jié)果進行半定量判定。隨機選取5個高倍視野,按鱗狀上皮細胞或鱗狀細胞癌細胞的胞漿顯色深淺評分,無顯色為陰性記0分,淺褐色為弱陽性記1分,棕褐色為陽性記2分,顆粒狀深棕褐色為強陽性記3分；按顯色組織的比例評分：顯色<25%為1分,顯色25%～50%為2分,顯色51%～75%為3分,顯色>75%為4分。根據(jù)二者的乘積將顯色程度分為4級,0分為陰性記0級,1～4分為弱陽性記1級,5～8分為陽性記2級,9～12分為強陽性記3級。4.細胞培養(yǎng)人喉癌細胞株Hep-2,采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)。采用對數(shù)期生長的細胞用于實驗。

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