背景^[1-3]

CALU-1人肺癌細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)等領(lǐng)域。這種細(xì)胞系是從一名47歲的白人男性患者的肺鱗癌胸腔積液轉(zhuǎn)移病灶中分離出來(lái)的。CALU-1細(xì)胞表現(xiàn)出上皮細(xì)胞樣的形態(tài)，具有豐富的超微結(jié)構(gòu)特征，包括微絨毛、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和脂包含體，并且不含有病毒顆粒。此外，這些細(xì)胞含有ras（H-ras和K-ras）癌基因。

在培養(yǎng)方面，CALU-1細(xì)胞在McCoy’s 5A培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，需要添加10%的胎牛血清和1%的抗生素/抗真菌劑。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2，并且建議每周更換培養(yǎng)基2-3次。傳代時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，可以使用0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化細(xì)胞，然后按照1:2到1:4的比例傳代。

CALU-1細(xì)胞具有致瘤性，能在裸鼠身上形成表皮樣癌，在類固醇治療的倉(cāng)鼠中形成轉(zhuǎn)移。這些細(xì)胞也表現(xiàn)出血型A、Rh+抗原表達(dá)，并具有HLA A10、A11、B15、Bw35的抗原譜。在分子水平上，它們是亞三倍體，模態(tài)染色體數(shù)目為62，存在7個(gè)頻繁出現(xiàn)的標(biāo)記物。

CALU-1人肺癌細(xì)胞

CALU-1人肺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇CALU-1人肺癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)CALU-1人肺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)CALU-1人肺癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

CALU-1人肺癌細(xì)胞可以用于單核細(xì)胞在新型冠狀病毒引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴中的作用和機(jī)制研究

圍繞單核細(xì)胞的功能和細(xì)胞因子分泌,來(lái)探討其在新型冠狀病毒引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴中的作用和機(jī)制,以期對(duì)COVID-19的治療提供參考數(shù)據(jù)。已有研究表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE-2)為引起SARS冠狀病毒和新型冠狀病毒的主要結(jié)合受體。

本研究以流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CALU-1人肺癌細(xì)胞表面高表達(dá)ACE-2蛋白。用SARS-Co V-2刺突蛋白S刺激CALU-1人肺癌細(xì)胞,經(jīng)i TRAQ蛋白組分析后與人類蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)GM-CSF和CD40L的表達(dá)明顯升高,可能導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞通過(guò)CD40L/CD40途徑,調(diào)節(jié)肺部單核細(xì)胞活化和炎癥細(xì)胞因子的分泌。利用Western blotting和q RT-PCR方法,對(duì)i TRAQ蛋白檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了印證。接下來(lái),取來(lái)自志愿者提供的人濃縮白細(xì)胞,分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),建立肺上皮細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),研究SARS-Co V-2激活單核細(xì)胞的作用和機(jī)制。

不同濃度的SARS-Co V-2-S刺激CALU-1人肺癌細(xì)胞,ELISA和PCR實(shí)驗(yàn)分析GM-CSF的分泌和表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)分析CD40L的表達(dá)。結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S可以顯著上調(diào)Calu-1細(xì)胞GM-CSF的分泌和CD40L的表達(dá)(P<0.01)。ACE-2抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證明,SARS-Co V-2-S作用于CALU-1人肺癌細(xì)胞依賴于ACE-2受體。SARS-Co V-2-S刺激Calu-1細(xì)胞與單核細(xì)胞后,檢測(cè)單核細(xì)胞表型和炎癥因子的分泌,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表型。

結(jié)果顯示,CALU-1人肺癌細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng),并不能引起單核細(xì)胞表型變化,但是當(dāng)在共培養(yǎng)體系中加入SARS-Co V-2-S后,單核細(xì)胞表達(dá)的CD86(2.1±0.22,P<0.05)和HLA-DR(3.5±0.32,P<0.01)顯著增高,提示單核細(xì)胞獲得了M1性巨噬細(xì)胞的炎癥表型。細(xì)胞內(nèi)染色和ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S通過(guò)Calu-1細(xì)胞刺激單核細(xì)胞分泌IL-18和IL-1β,說(shuō)明SARS-Co V-2-S通過(guò)作用于肺上皮細(xì)胞激活單核細(xì)胞,促進(jìn)了單核細(xì)胞向M1炎癥表型的分化。

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S通過(guò)激活CALU-1人肺癌細(xì)胞的PI3K/AKT,誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞分泌GM-CSF,并上調(diào)表達(dá)了CD40L。在SARSCo V-2-S刺激的Calu-1細(xì)胞與單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,加入CD40的封閉抗體或GM-CSF的中和性抗體,單核細(xì)胞的CD86的表達(dá)和HLA-DR的表達(dá)明顯下降(P<0.05),細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-18和IL-1β顯著下降(P<0.01)。以上結(jié)果表明,SARS-Co V-2-S激活CALU-1人肺癌細(xì)胞,通過(guò)CD40L/CD40和GM-CSF參與單核細(xì)胞的活化,引起單核細(xì)胞炎癥表型和炎癥細(xì)胞因子的分泌。

綜上所述,本研究探討了單核細(xì)胞在新型冠狀病毒引發(fā)的細(xì)胞因子風(fēng)暴中的作用和機(jī)制。發(fā)現(xiàn)了SARS-Co V-2通過(guò)S蛋白結(jié)合CALU-1人肺癌細(xì)胞表面ACE-2受體,激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT通路,誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞分泌GM-CSF,并上調(diào)表達(dá)了CD40L。激活Calu-1細(xì)胞,通過(guò)CD40L/CD40和GM-CSF參與單核細(xì)胞的活化,引起單核細(xì)胞炎癥表型和炎癥細(xì)胞因子的分泌。

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