背景及概述[1][2]
增強型HRP－DAB底物顯色試劑盒僅限用于科研，不得作其它用途！檢測方法：比色法，elisa，高效液相等。增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒中含有檢測辣根過氧化物酶（HRP）的所有試劑，適合于免疫組化中的組織切片染色或Western blot 雜交的PVDF 膜、尼龍膜等的染色。經免疫反應固定的辣根過氧化物酶可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置轉變?yōu)樗{紫色的化合物，可根據(jù)顏色反應來鑒定辣根過氧化物酶的量，進而確定目的蛋白的位置及含量。產品特點:該顯色試劑盒由試劑A：DAB底物儲存液；試劑B: 穩(wěn)定的過氧化物；試劑C: 增色溶液組成。顯色過程中需要避光，在顯色后可拍照或掃描。使用A、B、C 試劑顯色后的免疫組織可用Nuclear fast red 復染。應用范圍:Western blot 沉淀；免疫組化；其它通過沉淀反應檢測HRP 的應用。
應用 [2]
一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體步驟如下：
(1)海帶雌配子體細胞的轉化
①生長中的海帶雌配子體細胞品系13號的細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的 海帶雌配子體細胞團，細胞密度為5×105-2×106個/mL(用血球計數(shù)板計數(shù))。轉化時用60mm 的無菌培養(yǎng)皿，將雌雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈。
②用試劑盒提取質粒pBA002-z108β的DNA，用以轟擊后的共培養(yǎng)和基因轉化。
③對海帶雌配子體細胞團進行轟擊：打開PDS-1000\He型基因槍電源，打開氦氣瓶閥門，旋轉氦氣調節(jié)桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi左右，即1500psi；擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；
④向轟擊后的海帶配子體細胞團內加入pBA002-z108β質粒DNA，培養(yǎng)溫度是11-13℃，光照為800Lux，共培養(yǎng)48小時；
⑤在草丁膦40mg/L的濃度下篩選轉化的雌配子體細胞。
(2)重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細胞中的表達
轉化后的雌配子體細胞培養(yǎng)28-35d，挑取克隆單獨培養(yǎng)。將海帶配子體均勻涂布 在帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下用毛細管挑取褐色的轉化體，加入培養(yǎng)液大量培養(yǎng)。培養(yǎng)海帶雌配子體細胞的營養(yǎng)液為：滅菌海水中添加濃度為10.0g/L的NaNO3和濃度為1.0g/L 的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量為每升海水添加1.0-10.0mL；KH2PO4溶液的添加量為每 升海水添加0.4-1.0mL。并且每天更換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度是11-13℃，每天為光照培養(yǎng)14 小時、暗培養(yǎng)10小時，光照為800Lux；將轉化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉化體培養(yǎng)5-10d。
對篩選出來的海帶雌配子體細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)，連續(xù)不停地進行PCR檢測，優(yōu)化 海帶配子體轉基因的方法，提高轉化率和轉化體的成活率，建立完整的海帶雌配子體細胞 無性繁殖體系。海帶雌配子體細胞培養(yǎng)兩周后在草丁膦40mg/L的濃度下保持褐色，未被草丁膦殺死，也有部分海帶配子體變綠，褪色，是未被轉化的、不含有重組玉米蛋白z108β的雌配子體細胞。
(3)重組玉米蛋白z108β的提取和純化
①海帶雌配子體轉化體細胞的破碎和分離
取0.1g樣品放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液(sample buffer)200μL(1.0M tris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巰基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL)，混合后煮沸 5min，12000rpm離心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE電泳鑒定
取20μL上清液，用于點樣檢驗；SDS-PAGE電泳采用10％的分離膠(去離子水9.9mL， 30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％過硫酸銨(AP) 0.25mL，TEMED 0.01mL)和積層膠(無離子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8) 1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。
蛋白樣品上樣，每孔20μL，80V電壓下電泳30分鐘后電壓120V電泳60-80分鐘。
③重組玉米蛋白z108β的蛋白印跡法驗證和純化
海帶雌配子體細胞轉化體的驗證使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置進行PVDF轉 膜，電流90mA，轉膜100min。轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的去離子水中，漂 洗1分鐘，以洗去膜上的轉膜液。放入封閉液中，搖床上封閉2小時。清洗后將膜浸于稀釋好 的一抗(新西蘭大白兔的Z108抗血清與5％脫脂奶粉的比例為1：1000)中，37℃孵育1-2h；用 10mLTBST洗膜3次；再將膜浸于稀釋好的二抗(HRP標記的羊抗兔IgG與5％脫脂奶粉的比例 為1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色拍照。
獲得的重組玉米蛋白用8kD的再生棉絨纖維素透析膜(貨號F128056-0001，上海生工)透析除鹽，并12000rpm離心20分鐘沉淀。
④重組蛋白的濃縮和保藏
將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米蛋白z108β在-20℃條件下保存。經電泳蛋白標準測試，重組玉米蛋白z108β的含量達到0.2μg/μL；純度達到 99.9％。本發(fā)明中除特殊說明外，“％”均表示質量濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明首次通過海帶配子體細胞的大量培養(yǎng)獲得純度達到99.9％的重組玉米蛋白，這一發(fā)明使得人工條件下實現(xiàn)目標基因編碼蛋白的表達量能夠滿足實際應用的要求；
2、重組玉米蛋白z108β是一種具有抑制鱗翅目昆蟲發(fā)育的作用，該基因在海帶配子體細胞的表達使得海帶雌配子體細胞成為一種可以生產生物農藥的生物反應器。
3、在水生植物中表達陸生植物的重組蛋白，而且大規(guī)模培養(yǎng)條件下分裂的雌配子體細胞具有目標基因的遺傳穩(wěn)定性。
主要參考資料
[1] 增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒說明書
[2] CN201611194909.0 一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法