背景及概述[1][2]
增強(qiáng)型HRP－DAB底物顯色試劑盒僅限用于科研，不得作其它用途！檢測(cè)方法：比色法，elisa，高效液相等。增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒中含有檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的所有試劑，適合于免疫組化中的組織切片染色或Western blot 雜交的PVDF 膜、尼龍膜等的染色。經(jīng)免疫反應(yīng)固定的辣根過(guò)氧化物酶可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色的化合物，可根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)鑒定辣根過(guò)氧化物酶的量，進(jìn)而確定目的蛋白的位置及含量。產(chǎn)品特點(diǎn):該顯色試劑盒由試劑A：DAB底物儲(chǔ)存液；試劑B: 穩(wěn)定的過(guò)氧化物；試劑C: 增色溶液組成。顯色過(guò)程中需要避光，在顯色后可拍照或掃描。使用A、B、C 試劑顯色后的免疫組織可用Nuclear fast red 復(fù)染。應(yīng)用范圍:Western blot 沉淀；免疫組化；其它通過(guò)沉淀反應(yīng)檢測(cè)HRP 的應(yīng)用。
應(yīng)用 [2]
一種利用海帶雌配子體生產(chǎn)重組玉米蛋白的方法，具體步驟如下：
(1)海帶雌配子體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
①生長(zhǎng)中的海帶雌配子體細(xì)胞品系13號(hào)的細(xì)胞團(tuán)，研磨使之成含有5-7個(gè)細(xì)胞的 海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞密度為5×105-2×106個(gè)/mL(用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))。轉(zhuǎn)化時(shí)用60mm 的無(wú)菌培養(yǎng)皿，將雌雌配子體細(xì)胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈。
②用試劑盒提取質(zhì)粒pBA002-z108β的DNA，用以轟擊后的共培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化。
③對(duì)海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行轟擊：打開(kāi)PDS-1000\He型基因槍電源，打開(kāi)氦氣瓶閥門(mén)，旋轉(zhuǎn)氦氣調(diào)節(jié)桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi左右，即1500psi；擋網(wǎng)與材料間距3cm時(shí)轟擊，轟擊壓力為1100psi；
④向轟擊后的海帶配子體細(xì)胞團(tuán)內(nèi)加入pBA002-z108β質(zhì)粒DNA，培養(yǎng)溫度是11-13℃，光照為800Lux，共培養(yǎng)48小時(shí)；
⑤在草丁膦40mg/L的濃度下篩選轉(zhuǎn)化的雌配子體細(xì)胞。
(2)重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細(xì)胞中的表達(dá)
轉(zhuǎn)化后的雌配子體細(xì)胞培養(yǎng)28-35d，挑取克隆單獨(dú)培養(yǎng)。將海帶配子體均勻涂布 在帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下用毛細(xì)管挑取褐色的轉(zhuǎn)化體，加入培養(yǎng)液大量培養(yǎng)。培養(yǎng)海帶雌配子體細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液為：滅菌海水中添加濃度為10.0g/L的NaNO3和濃度為1.0g/L 的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量為每升海水添加1.0-10.0mL；KH2PO4溶液的添加量為每 升海水添加0.4-1.0mL。并且每天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度是11-13℃，每天為光照培養(yǎng)14 小時(shí)、暗培養(yǎng)10小時(shí)，光照為800Lux；將轉(zhuǎn)化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)5-10d。
對(duì)篩選出來(lái)的海帶雌配子體細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，連續(xù)不停地進(jìn)行PCR檢測(cè)，優(yōu)化 海帶配子體轉(zhuǎn)基因的方法，提高轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化體的成活率，建立完整的海帶雌配子體細(xì)胞 無(wú)性繁殖體系。海帶雌配子體細(xì)胞培養(yǎng)兩周后在草丁膦40mg/L的濃度下保持褐色，未被草丁膦殺死，也有部分海帶配子體變綠，褪色，是未被轉(zhuǎn)化的、不含有重組玉米蛋白z108β的雌配子體細(xì)胞。
(3)重組玉米蛋白z108β的提取和純化
①海帶雌配子體轉(zhuǎn)化體細(xì)胞的破碎和分離
取0.1g樣品放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液(sample buffer)200μL(1.0M tris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巰基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL)，混合后煮沸 5min，12000rpm離心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE電泳鑒定
取20μL上清液，用于點(diǎn)樣檢驗(yàn)；SDS-PAGE電泳采用10％的分離膠(去離子水9.9mL， 30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％過(guò)硫酸銨(AP) 0.25mL，TEMED 0.01mL)和積層膠(無(wú)離子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8) 1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。
蛋白樣品上樣，每孔20μL，80V電壓下電泳30分鐘后電壓120V電泳60-80分鐘。
③重組玉米蛋白z108β的蛋白印跡法驗(yàn)證和純化
海帶雌配子體細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的驗(yàn)證使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn) 膜，電流90mA，轉(zhuǎn)膜100min。轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的去離子水中，漂 洗1分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。放入封閉液中，搖床上封閉2小時(shí)。清洗后將膜浸于稀釋好 的一抗(新西蘭大白兔的Z108抗血清與5％脫脂奶粉的比例為1：1000)中，37℃孵育1-2h；用 10mLTBST洗膜3次；再將膜浸于稀釋好的二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG與5％脫脂奶粉的比例 為1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色拍照。
獲得的重組玉米蛋白用8kD的再生棉絨纖維素透析膜(貨號(hào)F128056-0001，上海生工)透析除鹽，并12000rpm離心20分鐘沉淀。
④重組蛋白的濃縮和保藏
將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米蛋白z108β在-20℃條件下保存。經(jīng)電泳蛋白標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試，重組玉米蛋白z108β的含量達(dá)到0.2μg/μL；純度達(dá)到 99.9％。本發(fā)明中除特殊說(shuō)明外，“％”均表示質(zhì)量濃度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明首次通過(guò)海帶配子體細(xì)胞的大量培養(yǎng)獲得純度達(dá)到99.9％的重組玉米蛋白，這一發(fā)明使得人工條件下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因編碼蛋白的表達(dá)量能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的要求；
2、重組玉米蛋白z108β是一種具有抑制鱗翅目昆蟲(chóng)發(fā)育的作用，該基因在海帶配子體細(xì)胞的表達(dá)使得海帶雌配子體細(xì)胞成為一種可以生產(chǎn)生物農(nóng)藥的生物反應(yīng)器。
3、在水生植物中表達(dá)陸生植物的重組蛋白，而且大規(guī)模培養(yǎng)條件下分裂的雌配子體細(xì)胞具有目標(biāo)基因的遺傳穩(wěn)定性。
主要參考資料
[1] 增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)
[2] CN201611194909.0 一種利用海帶雌配子體生產(chǎn)重組玉米蛋白的方法