背景及概述^[1]

在生物體內(nèi)，NTPs/dNTPs參與核酸的生物合成會生成副產(chǎn)物焦磷酸鹽，體內(nèi)存在的焦磷酸鹽會在焦磷酸酶的催化作用下分解，減少焦磷酸累積可能造成的負(fù)面效應(yīng)。PCR利用嗜熱酶模擬體內(nèi)核酸復(fù)制的體外反應(yīng)，伴隨dNTPs的參入，焦磷酸的累積同樣會降低PCR擴(kuò)增的效率。焦磷酸的積累，會導(dǎo)致反應(yīng)混合物的pH降低，影響熒光染料的穩(wěn)定性。

為了去除這些焦磷酸對PCR的抑制，人們在PCR反應(yīng)中添加無機(jī)焦磷酸酶，用以將焦磷酸(PPi)會水解為正磷酸(Pi)。這種反應(yīng)，會使反應(yīng)混合液的pH增加，并是的熒光染料變得更穩(wěn)定。為了適應(yīng)PCR的高溫，這種焦磷酸酶必須能耐受95℃的高溫。重組表達(dá)了超嗜熱古菌(Pyrococcushorikoshii)的PPase基因，這種酶最適溫度為88℃，最適pH為10.3，并不適合PCR的使用。重組表達(dá)了嗜熱棲熱菌(Thermusthermophiles)HB27株的PPase基因。由此，基于嗜熱棲熱菌的PPase基因，構(gòu)建一種改造的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，這種酶可以應(yīng)用于需要更多循環(huán)數(shù)以及反應(yīng)時(shí)間的超敏PCR擴(kuò)增，增加反應(yīng)的擴(kuò)增效率。熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶特點(diǎn)：1）增強(qiáng)DNA復(fù)制2）100℃加熱4小時(shí)，酶仍具有100%活性。熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶來自重組E.coli菌株，攜帶從極度耐熱的Thermococuslitoralis中克隆的無機(jī)焦磷酸酶基因。

制備^[1]

熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，其序列為：

MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIADVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRAAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：1)。

將上述酶的位點(diǎn)進(jìn)行改造，改造位點(diǎn)及改造方法如下：將原酶的序列的第6位氨基酸T改造為氨基酸S；第11位氨基酸E改為氨基酸K；第72位氨基酸L改為氨基酸I或者第73位氨基酸V改為氨基酸I；第124位氨基酸D改造為氨基酸A；第160位氨基酸A改造為Q或K。獲得兩條氨基酸序列如下的熱穩(wěn)定焦磷酸酶：

無機(jī)焦磷酸酶1：

MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：2)。

無機(jī)焦磷酸酶2

MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQIDNO：3)。

按照上述焦磷酸酶的氨基酸序列人工合成對應(yīng)的堿基序列，擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)蛋白并進(jìn)行純化。

主要參考資料

[1] CN201710017276.4 一種改造的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶