背景及概述[1]
拓?fù)洚悩?gòu)酶是催化DNA的拓?fù)洚悩?gòu)體之間轉(zhuǎn)變的酶。該酶可以改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的連環(huán)數(shù)(linkingnumber),即L值。拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為兩類,Ⅰ類能使雙鏈超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松弛形環(huán)狀DNA,每一次反應(yīng)可使L值增加1。Ⅱ類則可使松弛環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成超螺旋形DNA,每次作用,可使L值減少2,又稱促旋酶。在多種拓?fù)洚悩?gòu)酶中,牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶I(VacciniatopoisomeraseI,VTopoI)是目前已知的最簡單、分子質(zhì)量最小、惟一一種存在于病毒內(nèi)的I型拓?fù)洚悩?gòu)酶,其由314個氨基酸殘基構(gòu)成,基因大小僅有945bp。
有研究建立了牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶(Vacciniatopoisomerase)的原核表達(dá)體系及純化方法,以獲得高活性、高純度的牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶。優(yōu)化并人工合成牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶的全基因序列,構(gòu)建牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的原核表達(dá)載體(pET28a/TOPO)并轉(zhuǎn)化E.coliBL21Star(DE3)菌株,優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)條件,表達(dá)蛋白經(jīng)Talonhis-tagpurificationresin螯合層析柱純化,用SDS-PAGE鑒定純化效果,借助酶切質(zhì)粒pLLP-OmpA檢測純化蛋白的活性。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pET28a/TOPO的E.coliBL21Star(DE3)特異地表達(dá)了牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶蛋白,誘導(dǎo)條件為30℃下以0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)12h。該蛋白經(jīng)鈷離子螯合層析柱純化后,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其為分子質(zhì)量36ku的蛋白。酶切和凍融試驗(yàn)結(jié)果表明,該酶具有高活性和高穩(wěn)定性。因此成功構(gòu)建了牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶的原核表達(dá)和純化體系,為后續(xù)拓?fù)洚悩?gòu)酶的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
主要參考資料
[1] 協(xié)和醫(yī)學(xué)詞典
[2] 牛痘病毒拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的原核表達(dá)與純化