背景[1-3]
TOP10感受態(tài)細胞是一種經(jīng)過特殊處理的細胞，具有高效轉化外源DNA的能力。這種細胞被廣泛應用于分子生物學和遺傳工程領域，用于轉化和表達外源基因。
TOP10感受態(tài)細胞的主要特點包括高轉化效率、穩(wěn)定性好以及基因突變少。這使得它成為處理難以轉化的DNA質(zhì)粒的理想選擇。相比其他常見的感受態(tài)細胞，如DH5α，TOP10在某些方面可能具有優(yōu)勢。
制備TOP10感受態(tài)細胞的過程通常涉及使用理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。這通常包括處理細胞以提高其通透性，使得細胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。
在使用TOP10感受態(tài)細胞進行轉化實驗時，需要向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉化的目的DNA。然后，通過一系列的溫度變化和處理步驟，如冰浴、熱激和復蘇培養(yǎng)，促進DNA進入細胞并進行表達。
TOP10感受態(tài)細胞
TOP10感受態(tài)細胞是一種高效、穩(wěn)定的工具，用于在實驗室中進行基因轉化和表達研究。然而，具體的應用和效果可能因?qū)嶒灄l件和目的的不同而有所差異。因此，在使用TOP10感受態(tài)細胞時，建議參考相關的實驗手冊和文獻，以確保實驗的準確性和可靠性。
制備和使用TOP10感受態(tài)細胞的操作步驟主要包括以下幾個關鍵步驟：
制備TOP10感受態(tài)細胞：
1.取適量TOP10菌液，接種至含適當營養(yǎng)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中，并在適宜的溫度和搖床速度下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
2.收集對數(shù)生長期的菌液，進行洗滌和離心，以去除培養(yǎng)基和其他雜質(zhì)。
3.使用特定的化學試劑（如氯化鈣）處理細胞，使其轉變?yōu)楦惺軕B(tài)狀態(tài)，此時細胞易于接受外源DNA。
4.將制備好的感受態(tài)細胞保存在適當?shù)臈l件下，以備后續(xù)使用。
5.取適量制備好的TOP10感受態(tài)細胞，加入需轉化的外源DNA（如質(zhì)粒）。
6.在冰上靜置一段時間，使DNA與感受態(tài)細胞充分接觸。
7.進行熱激處理，一般是在42℃水浴中短暫加熱，以促使DNA進入細胞。
8.熱激后立即將細胞置于冰上冷卻，并加入營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基進行復蘇培養(yǎng)，使細胞恢復正常生長狀態(tài)。
9.將復蘇培養(yǎng)后的菌液涂布于含有適當抗生素的固體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)。
10.觀察培養(yǎng)基上的菌落生長情況，挑選出可能含有轉化DNA的菌落。
11.對挑選出的菌落進行進一步鑒定，如PCR擴增、測序等，以確認是否成功轉化了所需的外源DNA。
應用[4-5]
TOP10感受態(tài)細胞可以用于表達H9N2禽流感病毒HA2蛋白重組乳酸菌的構建與免疫效果研究
將H9N2 AIV的主要保護性抗原HA2分別導入乳酸菌組成型表達系統(tǒng)和誘導型表達系統(tǒng),構建了兩株表達H9N2 AIV HA2蛋白的重組乳酸菌,旨在開發(fā)能夠防控H9N2 AIV的新型制劑。研究內(nèi)容及結果如下:1.表達H9N2 AIV HA2蛋白重組乳酸桿菌和重組乳酸乳球菌的構建:對H9N2 AIV流行毒株提取RNA,反轉錄為c DNA,擴增HA2全基因,連接至p MD18-T質(zhì)粒,熱激轉化到DH5α感受態(tài)細胞,構建出克隆質(zhì)粒p MD18-T-HA2。選擇NcoⅠ和HindⅢ雙酶切p32-p SIP409質(zhì)粒,將線性化載體p32-p SIP409和基因片段HA2通過同源重組酶連接,熱激轉化至TOP10感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒,電轉化入植物乳桿菌NC8感受態(tài)細胞,利用紅霉素抗性篩選陽性菌株。提取質(zhì)粒測序驗證,含正確重組質(zhì)粒的菌株命名為p32-p SIP409-HA2/NC8。重組菌株30℃靜置過夜自發(fā)表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白特異性,結果顯示重組植物乳桿菌p32-p SIP409-HA2/NC8成功表達27 k Da HA2蛋白。選擇NcoⅠ和KpnΙ同時雙酶切HA2基因片段和p NZ8149質(zhì)粒,通過T4 DNA連接酶進行連接,電轉化入乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細胞,利用Elliker培養(yǎng)基篩選陽性菌株。提取質(zhì)粒測序驗證,含正確重組質(zhì)粒的菌株命名為p NZ8149-HA2/NZ3900。通過Nisin對重組菌株進行誘導表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測目的蛋白特異性,結果顯示重組乳酸乳球菌p NZ3900-HA2/NZ3900成功表達27k Da HA2蛋白。
參考文獻
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