背景^[1-3]

人腎小管上皮細(xì)胞是從人類(lèi)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞中分離出的一類(lèi)多能性干細(xì)胞，可以分化為多種不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。這些細(xì)胞具有較高的增殖能力和特異性表型，因此被廣泛應(yīng)用于腎臟疾病研究和藥物篩選等領(lǐng)域。

在腎臟疾病研究中，人腎小管上皮細(xì)胞可以用于模擬腎臟疾病發(fā)生的過(guò)程，評(píng)估藥物的毒性和療效。例如，通過(guò)將人腎小管上皮細(xì)胞與不同濃度的藥物共培養(yǎng)，可以觀察到細(xì)胞的變化和損傷程度，從而評(píng)估藥物對(duì)腎臟的影響。此外，人腎小管上皮細(xì)胞還可以用于研究腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制，如腎小球腎炎、糖尿病腎病等。

在藥物篩選領(lǐng)域，人腎小管上皮細(xì)胞可以用于評(píng)估藥物的腎臟毒性和代謝情況。由于腎臟是藥物代謝和排泄的主要器官之一，因此評(píng)估藥物對(duì)腎臟的影響對(duì)于藥物的安全性和有效性至關(guān)重要。通過(guò)使用人腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，可以快速準(zhǔn)確地評(píng)估藥物的腎臟毒性和代謝情況，為藥物研發(fā)提供重要的支持。

人腎小管上皮細(xì)胞

人腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇人腎小管上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)人腎小管上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)人腎小管上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

人腎小管上皮細(xì)胞可以用于STAT3調(diào)控的自噬在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中的作用及氯沙坦對(duì)其的影響

研究血管緊張素II誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中STAT3通路、自噬參與的調(diào)控作用和機(jī)制,并觀察應(yīng)用血管緊張素II受體拮抗劑氯沙坦在改善腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中的作用和機(jī)制,并在小鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證,以期為延緩腎臟衰老、慢性腎臟病防治提供策略。

研究方法:1.建立血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞衰老模型并觀察自噬在其衰老過(guò)程中的變化及對(duì)衰老的影響。應(yīng)用10-6mol/L濃度的Ang II作用于人HK-2細(xì)胞0h至72h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、Western blot法檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P21表達(dá)水平、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色(SAβ-gal)檢測(cè)衰老細(xì)胞陽(yáng)性率方法以建立人腎小管上皮細(xì)胞衰老模型。此后應(yīng)用Ang II、3-MA作用于人HK-2細(xì)胞,并應(yīng)用Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3II、P62、衰老相關(guān)蛋白P21表達(dá)水平、電鏡檢測(cè)自噬體數(shù)量、LC3-GFP-m RFP自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染及激光共聚焦顯微鏡觀察自噬光斑數(shù)量、SAβ-gal檢測(cè)衰老細(xì)胞陽(yáng)性率,以觀察Ang II誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞自噬的變化及對(duì)衰老的影響。2.調(diào)控STAT3通路并觀察其在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中的作用及氯沙坦干預(yù)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞STAT3通路、自噬、衰老的影響。

應(yīng)用Ang II誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞衰老,使用Western blot法檢測(cè)STAT3/PI3KC3通路變化,并應(yīng)用S3I-201藥物阻斷及si RNA-STAT3基因阻斷STAT3并應(yīng)用Western blot法觀察p STAT3蛋白、PI3KC3蛋白、衰老相關(guān)蛋白P21、自噬相關(guān)蛋白LC3II、P62表達(dá)水平、電鏡檢測(cè)自噬體數(shù)量,LC3-GFP-m RFP自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染觀察自噬光斑數(shù)量、β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)衰老細(xì)胞陽(yáng)性率等指標(biāo)。在Ang II誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中應(yīng)用氯沙坦處理人HK-2細(xì)胞,并應(yīng)用Western blot法觀察p STAT3、P21、LC3II、P62表達(dá)水平、電鏡檢測(cè)自噬體數(shù)量,LC3-GFP-m RFP自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染觀察自噬光斑數(shù)量、SAβ-gal染色檢測(cè)衰老細(xì)胞陽(yáng)性率等方法觀察氯沙坦對(duì)HK-2細(xì)胞STAT3通路、自噬、衰老的影響及作用。

結(jié)果:1.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞衰老過(guò)程中自噬活性增強(qiáng)并介導(dǎo)其衰老。10-6mol/L濃度的Ang II作用于人HK-2細(xì)胞,CCK-8法結(jié)果顯示Ang II 0-72h促進(jìn)人HK-2細(xì)胞增殖,此后抑制細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ang II作用于人HK-2細(xì)胞72h后超過(guò)80%的細(xì)胞進(jìn)入G0-G1期,顯著高于正常對(duì)照組;Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,人HK-2細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P21表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增加,72h時(shí)P21蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組;SAβ-gal染色發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,人HK-2細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞陽(yáng)性率呈時(shí)間依賴性增加,48h、72h時(shí)與對(duì)照組相比均顯著增加,72小時(shí)達(dá)最高值。

參考文獻(xiàn)

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