背景^[1-3]

人腎小管上皮細胞是從人類腎臟內皮細胞中分離出的一類多能性干細胞，可以分化為多種不同類型的細胞，包括腎小管上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等。這些細胞具有較高的增殖能力和特異性表型，因此被廣泛應用于腎臟疾病研究和藥物篩選等領域。

在腎臟疾病研究中，人腎小管上皮細胞可以用于模擬腎臟疾病發(fā)生的過程，評估藥物的毒性和療效。例如，通過將人腎小管上皮細胞與不同濃度的藥物共培養(yǎng)，可以觀察到細胞的變化和損傷程度，從而評估藥物對腎臟的影響。此外，人腎小管上皮細胞還可以用于研究腎臟疾病的發(fā)病機制，如腎小球腎炎、糖尿病腎病等。

在藥物篩選領域，人腎小管上皮細胞可以用于評估藥物的腎臟毒性和代謝情況。由于腎臟是藥物代謝和排泄的主要器官之一，因此評估藥物對腎臟的影響對于藥物的安全性和有效性至關重要。通過使用人腎小管上皮細胞進行體外實驗，可以快速準確地評估藥物的腎臟毒性和代謝情況，為藥物研發(fā)提供重要的支持。

人腎小管上皮細胞

人腎小管上皮細胞培養(yǎng)操作

1)復蘇人腎小管上皮細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)人腎小管上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)人腎小管上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應用^[4-5]

人腎小管上皮細胞可以用于STAT3調控的自噬在血管緊張素Ⅱ誘導的腎小管上皮細胞衰老過程中的作用及氯沙坦對其的影響

研究血管緊張素II誘導的腎小管上皮細胞衰老過程中STAT3通路、自噬參與的調控作用和機制,并觀察應用血管緊張素II受體拮抗劑氯沙坦在改善腎小管上皮細胞衰老過程中的作用和機制,并在小鼠體內進行驗證,以期為延緩腎臟衰老、慢性腎臟病防治提供策略。

研究方法:1.建立血管緊張素Ⅱ誘導的人腎小管上皮細胞衰老模型并觀察自噬在其衰老過程中的變化及對衰老的影響。應用10-6mol/L濃度的Ang II作用于人HK-2細胞0h至72h,采用流式細胞術檢測細胞周期、Western blot法檢測衰老相關蛋白P21表達水平、衰老相關β-半乳糖苷酶染色(SAβ-gal)檢測衰老細胞陽性率方法以建立人腎小管上皮細胞衰老模型。此后應用Ang II、3-MA作用于人HK-2細胞,并應用Western blot法檢測自噬相關蛋白LC3II、P62、衰老相關蛋白P21表達水平、電鏡檢測自噬體數(shù)量、LC3-GFP-m RFP自噬雙標腺病毒轉染及激光共聚焦顯微鏡觀察自噬光斑數(shù)量、SAβ-gal檢測衰老細胞陽性率,以觀察Ang II誘導的人腎小管上皮細胞自噬的變化及對衰老的影響。2.調控STAT3通路并觀察其在血管緊張素Ⅱ誘導的人腎小管上皮細胞衰老過程中的作用及氯沙坦干預對人腎小管上皮細胞STAT3通路、自噬、衰老的影響。

應用Ang II誘導人腎小管上皮細胞衰老,使用Western blot法檢測STAT3/PI3KC3通路變化,并應用S3I-201藥物阻斷及si RNA-STAT3基因阻斷STAT3并應用Western blot法觀察p STAT3蛋白、PI3KC3蛋白、衰老相關蛋白P21、自噬相關蛋白LC3II、P62表達水平、電鏡檢測自噬體數(shù)量,LC3-GFP-m RFP自噬雙標腺病毒轉染觀察自噬光斑數(shù)量、β-半乳糖苷酶染色檢測衰老細胞陽性率等指標。在Ang II誘導人腎小管上皮細胞衰老過程中應用氯沙坦處理人HK-2細胞,并應用Western blot法觀察p STAT3、P21、LC3II、P62表達水平、電鏡檢測自噬體數(shù)量,LC3-GFP-m RFP自噬雙標腺病毒轉染觀察自噬光斑數(shù)量、SAβ-gal染色檢測衰老細胞陽性率等方法觀察氯沙坦對HK-2細胞STAT3通路、自噬、衰老的影響及作用。

結果:1.血管緊張素Ⅱ誘導人腎小管上皮細胞衰老過程中自噬活性增強并介導其衰老。10-6mol/L濃度的Ang II作用于人HK-2細胞,CCK-8法結果顯示Ang II 0-72h促進人HK-2細胞增殖,此后抑制細胞增殖;細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)Ang II作用于人HK-2細胞72h后超過80%的細胞進入G0-G1期,顯著高于正常對照組;Western blot結果顯示,與正常對照組相比,人HK-2細胞衰老相關蛋白P21表達水平呈時間依賴性增加,72h時P21蛋白表達水平顯著高于正常對照組;SAβ-gal染色發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,人HK-2細胞β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率呈時間依賴性增加,48h、72h時與對照組相比均顯著增加,72小時達最高值。

參考文獻

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[3]Accelerated Kidney Aging in Diabetes Mellitus.[J].Jing Guo;;Hui Juan Zheng;;Wenting Zhang;;Wenjiao Lou;;Chenhui Xia;;Xue Ting Han;;Wei Jun Huang;;Fan Zhang;;Yaoxian Wang;;Wei Jing Liu;;Gianna Ferretti.Oxidative medicine and cellular longevity,2020

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[5]李慧敏.STAT3調控的自噬在血管緊張素Ⅱ誘導的腎小管上皮細胞衰老過程中的作用及氯沙坦對其的影響[D].中國醫(yī)科大學,2022.