背景^[1-3]

HOECHST33258染色液是一種細(xì)胞核染色試劑，也是一種藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低。它可以穿透細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合，主要用于細(xì)胞核或常規(guī)的DNA染色，尤其在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中非常有用。HOECHST33258染色液的最大激發(fā)波長是346nm，最大發(fā)射波長為460nm。

在使用HOECHST33258染色液時(shí)，通常的步驟包括細(xì)胞爬片或組織切片，用PBS清洗，加入染色液避光孵育，再次用PBS清洗，然后用防熒光淬滅封片劑封片，最后在熒光顯微鏡下觀察或拍照。使用完畢后，染色液應(yīng)存放在-20℃并避光保存。

HOECHST33258染色液

HOECHST33258染色液的使用步驟如下：

1.對(duì)于固定的細(xì)胞或組織樣品，首先進(jìn)行適當(dāng)洗滌以去除固定劑。如果需要進(jìn)行免疫熒光染色，則先進(jìn)行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進(jìn)行HOECHST33258染色。

2.在貼壁細(xì)胞或組織切片上，加入適量的HOECHST33258染色液。注意，該染色液是一種非嵌入性熒光染料，可以在活細(xì)胞或固定細(xì)胞的DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合，從而使細(xì)胞核著色。

3.在室溫下避光染色一段時(shí)間，通常為10~15分鐘。染色時(shí)間可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

4.染色結(jié)束后，用PBS或其他適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞或組織，以去除多余的染色液。

5.使用抗熒光淬滅封片液封片，以防止熒光淬滅。

6.將樣本置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右。此時(shí)，細(xì)胞核應(yīng)呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光。

請(qǐng)注意，HOECHST33258染色液是有害物質(zhì)，使用時(shí)需要做好防護(hù)，如帶手套、口罩，穿實(shí)驗(yàn)服。同時(shí)，熒光容易淬滅，所以推薦使用防熒光淬滅封片劑封片，并在避光4℃下保存。另外，為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議即時(shí)拍照保存結(jié)果。

應(yīng)用^[4-5]

HOECHST33258可以用于蒸制輪葉黨參的化學(xué)成分分析及藥理活性研究

通過對(duì)鮮輪葉黨參洗凈、去皮,高壓滅菌蒸汽鍋105℃蒸1h,室溫下(25℃)干燥,得到蒸制輪葉黨參(steamed Codonopsis lanceolata,SCL),SCL粉末用10倍體積甲醇40℃提取90min,提取3次,所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得到SCL粗提液,作為后期實(shí)驗(yàn)的樣品及藥品使用;通過HPLC和LC/MS分析了蒸制輪葉黨參中的化學(xué)成分,檢測(cè)到其含有黨參炔苷及六種皂苷等成分,為其日后開發(fā)成藥品打下基礎(chǔ)。

本文通過建立H22肝癌移植瘤模型,觀察SCL粗提液的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果表明:SCL給藥組(200和400mg/Kg)能不同程度的抑制小鼠荷瘤的生長而且能夠延長H22荷瘤小鼠的生存時(shí)間,增加臟器指數(shù),提高血清中干擾素-γ(IFN-γ),腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6)和白介素-2(IL-2)的水平,降低VEGF的水平,無明顯毒副作用;此外,H&E和HOECHST33258染色結(jié)果表明:SCL能明顯誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞凋亡;免疫組化分析表明:SCL治療組能增強(qiáng)腫瘤組織中Bax的表達(dá)、降低Bcl-2和VEGF的蛋白表達(dá)水平,且呈劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明:SCL抗腫瘤機(jī)制至少部分是通過抑制H22腫瘤生長和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的,且400mg/Kg劑量組表現(xiàn)出顯著效果,說明SCL對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤有抑制作用,具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤活性。

此外,通過建立順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型,觀察SCL的腎保護(hù)活性。結(jié)果表明:SCL能夠降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎癥因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)的水平和腎組織中丙二醛(MDA)的含量;H&E和HOECHST33258染色說明SCL能夠抑制細(xì)胞凋亡;免疫組化結(jié)果顯示SCL各劑量給藥組均在不同程度上降低了Bax的表達(dá),并且升高了Bcl-2的表達(dá),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系。這說明SCL對(duì)順鉑所致的急性腎損傷具有保護(hù)作用。我們還建立了急性酒精性肝損傷模型,觀察SCL對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。

結(jié)果顯示:SCL有效地降低肝組織中ALT,AST和GSH的含量及血清中TG的水平;且能夠顯著性升高肝組織中MDA的含量;組織學(xué)分析表明SCL能夠減弱酒精所致的肝損傷,總體結(jié)果說明SCL對(duì)急性酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。最后,對(duì)SCL主要活性物質(zhì)——紫丁香苷(Syringin)對(duì)順鉑致急性腎損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究。HOECHST33258染色液染色結(jié)果表明:Syringin能夠顯著降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎癥因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)和腎組織中超氧化物岐化酶(SOD),谷胱甘肽(GSH),過氧化氫酶(CAT)的含量;H&E,HOECHST33258及過碘酸-雪夫染色液(AB-PAS)染色結(jié)果表明:Syringin能夠改善順鉑造成的腎損傷;免疫組化結(jié)果表明:Syringin能夠降低Bax和Caspase-3的表達(dá),并且升高Bcl-2的表達(dá),上述結(jié)果表明紫丁香苷(Syringin)對(duì)順鉑所致的小鼠急性腎損傷具有保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis of hepatocellular carcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway in H22 tumor-bearing mice[J].Fangfang Yang;;Jingmin Li;;Jinhui Zhu;;Dong Wang;;Shaoshui Chen;;Xianyong Bai.European Journal of Pharmacology,2015

[2]Total saponins from Albizia julibrissin inhibit vascular endothelialgrowth factor-mediated angiogenesis in vitro and in vivo[J].Weiwei Cai;;Yue Li;;Qingqing Yi;;Fengshan Xie;;Bin Du;;Lei Feng;;Liying Qiu.Molecular Medicine Reports,2015(5)

[3]In-vitro Characterization and Evaluation of Apoptotic Potential of Bicistronic Plasmid Encoding HN Gene of Newcastle Disease Virus and Human TNF-α[J].R.S.Rajmani;;PrafullKumar Singh;;G.Ravi Kumar;;Shikha Saxena;;LakshyaVeer Singh;;Rajiv Kumar;;AdityaP.Sahoo;;ShishirKumar Gupta;;Uttara Chaturvedi;;AshokK.Tiwari.Animal Biotechnology,2015(2)

[4]Anti-hepatoma activity and mechanism of corn silk polysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J].Jingyue Yang;;Xiao Li;;Yan Xue;;Nan Wang;;Wenchao Liu.International Journal of Biological Macromolecules,2014

[5]徐頎.蒸制輪葉黨參的化學(xué)成分分析及藥理活性研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2017.