背景^[1-3]

低限量EAGLE培養(yǎng)基，也稱為MEM細胞培養(yǎng)基，是在Eagle's基礎培養(yǎng)基（BME）的基礎上改良而來的。它于1959年進行修改，刪去了賴氨酸和生物素，并增加了氨基酸的濃度，從而使其更適合多種細胞的單層生長。這種培養(yǎng)基具有高壓滅菌的品種，是最基本且適用范圍最廣的培養(yǎng)基之一。

然而，由于營養(yǎng)成分的限制，低限量Eagle培養(yǎng)基在針對特定細胞的培養(yǎng)與表達時，可能并非效果最佳或最經濟的選擇。此外，這種培養(yǎng)基中缺乏L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-谷氨酰胺，但補充了L-Ala-L-Gln二肽，為細胞培養(yǎng)提供了更穩(wěn)定的谷氨酰胺形式，因為游離氨基酸L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中是不穩(wěn)定的。

低限量Eagle培養(yǎng)基常用于在FBS、小?；蝰R血清存在下生長附著的細胞系，例如成纖維細胞。它已廣泛應用于各種細胞培養(yǎng)實驗，為科研工作者提供了重要的實驗工具。

低限量EAGLE培養(yǎng)基

低限量Eagle培養(yǎng)基使用步驟：

1.配置前準備：首先，需要準備新制備的milli water用于配置培養(yǎng)基，并確保調節(jié)pH值的酸堿溶液也使用這種水配置。同時，用于制備培養(yǎng)基的器皿需要清洗干凈，并用milli water潤洗兩次。

2.溶解培養(yǎng)基：取一定量的milli water（如5%終體積）加入到適當的容器中（如1L玻璃杯）。然后，將干粉培養(yǎng)基倒入燒杯，并用水沖洗包裝袋內面兩次，將沖洗液也倒入培養(yǎng)液中。隨后，使用磁力攪拌器助溶，確保培養(yǎng)基完全溶解。

3.補加試劑：根據培養(yǎng)基包裝袋上的說明，加入必要的試劑。這可能包括NaHCO3、HEPES以及非必需氨基酸等。這些試劑的添加量需嚴格按照說明進行，以確保培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分平衡。

4.加抗生素：為了防止細菌污染，通常需要在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。常見的抗生素包括青霉素和鏈霉素，其終濃度一般為100U/ml。根據所需的總體積，計算出所需的抗生素儲備液量，并將其加入到培養(yǎng)基中。

5.調節(jié)pH值：加水到預定的體積（如1000ml），然后使用HCl或NaOH調節(jié)pH值到適當的范圍，通常為7.2。pH值的準確性對于細胞的生長和增殖至關重要。

6.過濾除菌：使用適當的濾膜（如0.22um濾膜）對培養(yǎng)基進行過濾，以去除其中的細菌和其他微生物。過濾后的培養(yǎng)基應分裝于小瓶中（如100或200ml），以便后續(xù)使用。過濾后，pH值可能會有所上升，通常上升0.1-0.3。

7.添加小牛血清：在臨用前，需要向培養(yǎng)基中加入一定比例的小牛血清，通常為10%。小牛血清是細胞培養(yǎng)中常用的補充物，它提供了細胞生長所需的多種生長因子和營養(yǎng)成分。

應用^[4-5]

低限量EAGLE培養(yǎng)基可以用于利用單細胞測序技術分析乳腺癌腫瘤干細胞基因組突變特點

選用單細胞體外微球形成模型對乳腺癌腫瘤干細胞進行富集,之后利用MDA擴增技術對單細胞微球和未成球單細胞的基因組分別進行擴增,利用多重聚合酶鏈式反應(Multiplex Polymerase Chain Reaction,Multiplex PCR)技術構建文庫,進行靶向測序,用以研究乳腺癌腫瘤干細胞基因組突變特點。

2.研究方法(1)(1)選用人乳腺癌細胞MDA-MB-231單細胞體外微球形成試驗,在顯微鏡下分離單個MDA-MB-231細胞,接種于低粘附96孔板內,在無血清、補充成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,b FGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、B-27細胞培養(yǎng)添加劑(B-27)的杜氏改良低限量EAGLE培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12,DMEM/F-12)培養(yǎng)基中培養(yǎng)單細胞7-10天;(2)對體外所形成的微球進行干性相關表型的驗證試驗。(2)(1)選取2個非腫瘤干細胞與3個腫瘤干細胞,利用多重鏈置換擴增(Multiple Displacement Amplification,MDA)反應方法擴增其全基因組;(2)利用多重PCR技術(Multiplex PCR)對已知腫瘤熱點突變靶區(qū)進行擴增建庫測序;(3)尋找靶區(qū)內乳腺癌腫瘤干細胞存在高頻突變的基因位點。(3)(1)對乳腺癌腫瘤干細胞高頻突變進行基因富集分析。

參考文獻

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