背景^[1-3]

低限量EAGLE培養(yǎng)基，也稱為MEM細(xì)胞培養(yǎng)基，是在Eagle's基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BME）的基礎(chǔ)上改良而來的。它于1959年進(jìn)行修改，刪去了賴氨酸和生物素，并增加了氨基酸的濃度，從而使其更適合多種細(xì)胞的單層生長。這種培養(yǎng)基具有高壓滅菌的品種，是最基本且適用范圍最廣的培養(yǎng)基之一。

然而，由于營養(yǎng)成分的限制，低限量Eagle培養(yǎng)基在針對特定細(xì)胞的培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)，可能并非效果最佳或最經(jīng)濟(jì)的選擇。此外，這種培養(yǎng)基中缺乏L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-谷氨酰胺，但補(bǔ)充了L-Ala-L-Gln二肽，為細(xì)胞培養(yǎng)提供了更穩(wěn)定的谷氨酰胺形式，因?yàn)橛坞x氨基酸L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中是不穩(wěn)定的。

低限量Eagle培養(yǎng)基常用于在FBS、小?；蝰R血清存在下生長附著的細(xì)胞系，例如成纖維細(xì)胞。它已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，為科研工作者提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

低限量EAGLE培養(yǎng)基

低限量Eagle培養(yǎng)基使用步驟：

1.配置前準(zhǔn)備：首先，需要準(zhǔn)備新制備的milli water用于配置培養(yǎng)基，并確保調(diào)節(jié)pH值的酸堿溶液也使用這種水配置。同時(shí)，用于制備培養(yǎng)基的器皿需要清洗干凈，并用milli water潤洗兩次。

2.溶解培養(yǎng)基：取一定量的milli water（如5%終體積）加入到適當(dāng)?shù)娜萜髦校ㄈ?L玻璃杯）。然后，將干粉培養(yǎng)基倒入燒杯，并用水沖洗包裝袋內(nèi)面兩次，將沖洗液也倒入培養(yǎng)液中。隨后，使用磁力攪拌器助溶，確保培養(yǎng)基完全溶解。

3.補(bǔ)加試劑：根據(jù)培養(yǎng)基包裝袋上的說明，加入必要的試劑。這可能包括NaHCO3、HEPES以及非必需氨基酸等。這些試劑的添加量需嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，以確保培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分平衡。

4.加抗生素：為了防止細(xì)菌污染，通常需要在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。常見的抗生素包括青霉素和鏈霉素，其終濃度一般為100U/ml。根據(jù)所需的總體積，計(jì)算出所需的抗生素儲(chǔ)備液量，并將其加入到培養(yǎng)基中。

5.調(diào)節(jié)pH值：加水到預(yù)定的體積（如1000ml），然后使用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值到適當(dāng)?shù)姆秶ǔ?.2。pH值的準(zhǔn)確性對于細(xì)胞的生長和增殖至關(guān)重要。

6.過濾除菌：使用適當(dāng)?shù)臑V膜（如0.22um濾膜）對培養(yǎng)基進(jìn)行過濾，以去除其中的細(xì)菌和其他微生物。過濾后的培養(yǎng)基應(yīng)分裝于小瓶中（如100或200ml），以便后續(xù)使用。過濾后，pH值可能會(huì)有所上升，通常上升0.1-0.3。

7.添加小牛血清：在臨用前，需要向培養(yǎng)基中加入一定比例的小牛血清，通常為10%。小牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的補(bǔ)充物，它提供了細(xì)胞生長所需的多種生長因子和營養(yǎng)成分。

應(yīng)用^[4-5]

低限量EAGLE培養(yǎng)基可以用于利用單細(xì)胞測序技術(shù)分析乳腺癌腫瘤干細(xì)胞基因組突變特點(diǎn)

選用單細(xì)胞體外微球形成模型對乳腺癌腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行富集,之后利用MDA擴(kuò)增技術(shù)對單細(xì)胞微球和未成球單細(xì)胞的基因組分別進(jìn)行擴(kuò)增,利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Multiplex Polymerase Chain Reaction,Multiplex PCR)技術(shù)構(gòu)建文庫,進(jìn)行靶向測序,用以研究乳腺癌腫瘤干細(xì)胞基因組突變特點(diǎn)。

2.研究方法(1)(1)選用人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231單細(xì)胞體外微球形成試驗(yàn),在顯微鏡下分離單個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞,接種于低粘附96孔板內(nèi),在無血清、補(bǔ)充成纖維細(xì)胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor,b FGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、B-27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑(B-27)的杜氏改良低限量EAGLE培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物F-12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12,DMEM/F-12)培養(yǎng)基中培養(yǎng)單細(xì)胞7-10天;(2)對體外所形成的微球進(jìn)行干性相關(guān)表型的驗(yàn)證試驗(yàn)。(2)(1)選取2個(gè)非腫瘤干細(xì)胞與3個(gè)腫瘤干細(xì)胞,利用多重鏈置換擴(kuò)增(Multiple Displacement Amplification,MDA)反應(yīng)方法擴(kuò)增其全基因組;(2)利用多重PCR技術(shù)(Multiplex PCR)對已知腫瘤熱點(diǎn)突變靶區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增建庫測序;(3)尋找靶區(qū)內(nèi)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞存在高頻突變的基因位點(diǎn)。(3)(1)對乳腺癌腫瘤干細(xì)胞高頻突變進(jìn)行基因富集分析。

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