介紹

普卡那肽(plecana tide)由美國Synergy制藥公司研發(fā),是尿鳥苷蛋白(uroguanylin)的類似物，具有促尿鈉排泄的鳥苷酸環(huán)化酶受體激動藥的作用,能調節(jié)胃腸道中的酸堿離子，誘導液體轉運進入胃腸道,增加胃腸道的蠕動,適用于治療成人慢性特發(fā)性便秘。普卡那肽是含有雙二硫鍵連接的16個氨基酸的環(huán)狀多肽，它是鳥苷酸環(huán)化酶?C肽的激動劑。

普卡那肽

合成

以往合成的缺點

目前普卡那肽合成方法主要分為一步成環(huán)和分步成環(huán)法：

一步成環(huán)法即為氨基酸經過固相逐級法拼接，其中兩組Cys都屬于統(tǒng)一保護基，切割樹脂、經氧化成環(huán)一步完成兩個二硫鍵S?S的構建，得到普卡那肽粗品，通過純化凍干得到普卡那肽。分步成環(huán)法即為兩組Cys采用不同保護基，有選擇的分步完成兩個二硫鍵S?S的構建，通過純化凍干得到普卡那肽。

不管是一步成環(huán)還是分步成環(huán)，肽序合成過程異常困難，氨基酸的偶聯(lián)效率隨著鏈長的增加而降低，產生大量的雜質，加大了純化分離雜質難度，同時環(huán)化后產品會不具有生物活性的異構體雜質峰，導致整體收率和純度偏低，另外一步成環(huán)，無法定向選擇二硫鍵的形成，造成多個雜質峰，無法有效的判斷二硫鍵的正確構成。

新合成方法

為解決上述技術問題，宋亮[1]提供了一種普卡那肽的制備方法。本發(fā)明采用分步成環(huán)法和片段法合成普卡那肽，提升偶聯(lián)效率，減少了雜質的產生，提高了粗肽的純度和收率，通過目的性的選取氨基酸側鏈保護基控制普卡那肽成環(huán)順序，減少錯誤環(huán)化產生的無活性雜質，提高了成品純度和總體收率。

具體步驟如下：將片段Boc?Asn(Trt)?Asp(OtBu)?Glu(OtBu)?Cys(Trt)?Glu(OtBu)?Leu?OH(22.01g)、N,N?二異丙基碳二亞胺(2.8mL)和1?羥基苯并三唑(2.43g)加入DMF(150m L)中攪拌溶解活化，加入H?Cys(Acm)?Val?Asn(Trt)?Val?Ala?Cys(Trt)?Thr(tBu)?Gly?Cys(Acm)?Leu?Wang Resin的反應柱中，在25?30℃下反應2小時，通過Kaiser顏色測試監(jiān)測反應的完成，反應完成后，排干溶劑并用DMF(3×150mL)和洗滌樹脂，加入無水甲醇(3×150m L)收縮樹脂，干燥得普卡那肽肽樹脂。將所得粗肽加入10％乙腈水中溶解，濃度約為1mg/mL。使用氨水將溶液pH值調節(jié)至8?9，攪拌直至完全溶解，向粗肽溶液中，加入10當量30％H2O2溶液。在室溫下攪拌反應，通過HPLC監(jiān)測反應進程，反應完成后，使用TFA將反應物料的p H值調節(jié)至5?6終止反應，過濾得到單環(huán)肽粗肽溶液并純化；將上述純化后的溶液稀釋至濃度0.5mg/ml，向反應物料中加入含碘(2當量)的乙腈溶液，直到溶液黃色持續(xù)存在，環(huán)化溫度控制在20℃以下，通過HPLC監(jiān)測反應進程。反應完成后，加入抗壞血酸終止至黃色溶液澄清，用醋酸調節(jié)p H至5。將反應液進行過濾取濾液，所得濾液即含有雙環(huán)肽粗品；將上述實施例6收集得到純度≥99％的普卡那肽雙環(huán)肽溶液進行脫鹽洗脫；將所得洗脫后的普卡那肽溶液旋蒸濃縮得到濃縮液，冷凍干燥后得到普卡那肽純品(純度99.70％)。

該方法采用分步成環(huán)法和片段法(片段合成法6+10策略)合成普卡那肽，降低了合成難度，提升偶聯(lián)效率，分步成環(huán)法可以定向成環(huán)，確保成環(huán)順序正確，兩步成環(huán)過程中進行純化，減少了環(huán)化過程中產生的難除雜質，減少了雜質的產生，提高了粗肽的純度和收率，通過目的性的選取氨基酸側鏈保護基控制普卡那肽成環(huán)順序，減少錯誤環(huán)化產生的無活性雜質(例如無活性異構體雜質)，提高了成品純度和總體收率。

參考文獻

[1]宋亮,顧維煒,郭晨晨等.一種普卡那肽的制備方法[P].江蘇省:CN117603312A,2024-02-27.