背景^[1-3]

狗腎上皮細(xì)胞是一種狗腎上皮細(xì)胞株。這些細(xì)胞是從表觀正常的成年雌性可卡犬的腎臟中建立的，并經(jīng)過克隆過程得到。當(dāng)維持高細(xì)胞濃度時，狗腎上皮細(xì)胞能夠形成大量的小管。為了形成這些小管，細(xì)胞需要每天兩次換液以提供足夠的養(yǎng)分。

與原始細(xì)胞株相比，狗腎上皮細(xì)胞的c-AMP檢測水平較低，同時在forskolin刺激下讀出的腺苷環(huán)化酶水平也較低。此外，其跨上皮抗性也比Super Dome和MDCK細(xì)胞低。在狗狗的泌尿系統(tǒng)中，上皮細(xì)胞的存在是正常的。它們通常存在于狗尿沉渣中，包括少量紅細(xì)胞或白細(xì)胞以及上皮細(xì)胞。此外，年母畜尿中還會含有大量的鱗狀上皮細(xì)胞，這些都是正常的生理現(xiàn)象。然而，如果狗狗的泌尿系統(tǒng)受到細(xì)菌感染，可能會導(dǎo)致尿道上皮損傷，使上皮細(xì)胞脫落，從而可能引發(fā)結(jié)石等問題。

另外，狗腎上皮細(xì)胞還與狗狗的配種健康程度有關(guān)。在狗狗的陰道中，未角化的細(xì)胞和角化細(xì)胞的比例可以反映狗狗的配種狀況。當(dāng)狗狗接近最佳配種時間時，陰道中角化上皮細(xì)胞的比例會增加，而未角化細(xì)胞和紅血球的比例則會減少。

狗腎上皮細(xì)胞

狗腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇狗腎上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)狗腎上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)狗腎上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

狗腎上皮細(xì)胞可以用于豬骨湯胞內(nèi)抗氧化活性評價模型的研究

由于骨湯對健康的功效為人們廣泛相信,它成為一種長期且廣泛被飲用的湯品?，F(xiàn)有針對骨湯開展的生物學(xué)功效研究較少,飲用骨湯的益處缺乏數(shù)據(jù)支持。

通過針對性地構(gòu)建細(xì)胞胞內(nèi)抗氧化活性評價模型,確立評價骨湯在細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力合適的方法，通過該模型比較豬骨湯和清湯(工業(yè)湯)之間以及骨湯不同粒徑組分之間胞內(nèi)抗氧化能力,并結(jié)合骨湯生物化學(xué)和膠體化學(xué)性質(zhì)對上述抗氧化能力的差異進行闡述,嘗試獲得骨湯在體內(nèi)抗氧化作用機制的梗概,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：(1)構(gòu)建骨湯的胞內(nèi)抗氧化活性評價模型,通過對不同組織來源的細(xì)胞,細(xì)胞胞內(nèi)本底自由基和外加氧化劑產(chǎn)生的影響等相關(guān)因素進行考察和篩選,最后確定了以上皮細(xì)胞系的人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)和狗腎上皮細(xì)胞作為適合評價骨湯抗氧化活性的細(xì)胞模型。

(2) 通過比較化學(xué)法和細(xì)胞內(nèi)抗氧化模型的結(jié)果,骨湯在化學(xué)法和胞內(nèi)抗氧化模型存在極大的差異,這說明骨湯在化學(xué)水平和細(xì)胞水平的抗氧化作用機制可能不同,化學(xué)法測定骨湯直接作用于自由基,而在細(xì)胞內(nèi)骨湯則更可能是通過作用于胞內(nèi)抗氧化酶系而影響自由基水平。胞內(nèi)抗氧化模型能相對更客觀反映骨湯在體內(nèi)發(fā)揮生物功效的作用。

(3) 通過構(gòu)建的胞內(nèi)抗氧化體系對骨湯和清湯的抗氧化活性進行平行的測定,骨湯和清湯表現(xiàn)出不同的抗氧化活性,在上皮細(xì)胞Caco-2胞內(nèi)清湯和骨湯的抗氧化能力基本一致,而對狗腎上皮細(xì)胞清湯抗氧化能力不及骨湯,化學(xué)法測定清湯抗氧化能力強于骨湯,說明骨湯經(jīng)過工業(yè)化處理得到清湯時發(fā)生了構(gòu)造改變,并可能表現(xiàn)為化學(xué)水平和細(xì)胞水平的抗氧化作用差異。

(4)以胞內(nèi)抗氧化體系對骨湯及其不同粒徑組分的抗氧化活性進行對比測定,結(jié)果以Caco-2胞內(nèi)抗氧化能力衡量的強弱順序為真溶液、顆粒和骨湯原湯,而在狗腎上皮細(xì)胞的表現(xiàn)則相反。這兩種上皮細(xì)胞代表了體內(nèi)不同組織來源,這可能和骨湯經(jīng)口進入消化道后,其具有生物學(xué)效應(yīng)的成分會依照粒徑大小在不同部位進行轉(zhuǎn)運、吸收和作用有關(guān)系。

參考文獻

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