背景^[1-3]

H-4-II-E細(xì)胞系是一種來源于大鼠的肝細(xì)胞系，經(jīng)常被用于毒理學(xué)和藥物代謝研究。這種細(xì)胞系是由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的致癌研究所（NCI）建立的，并被廣泛用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝臟的潛在毒性。

H-4-II-E細(xì)胞系來源于一只雌性Sprague-Dawley大鼠的肝臟腫瘤，經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)，保持了穩(wěn)定的遺傳特性。這些細(xì)胞在培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出典型的肝細(xì)胞形態(tài)和功能，如合成蛋白質(zhì)、儲(chǔ)存糖原和代謝藥物等。

由于H-4-II-E細(xì)胞系具有與人體肝細(xì)胞相似的代謝酶活性，因此被廣泛用于藥物代謝和毒理學(xué)研究。這些細(xì)胞可以用于評(píng)估藥物在肝臟中的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的生成以及藥物對(duì)肝臟的潛在毒性。此外，H-4-II-E細(xì)胞系也可用于篩選潛在的抗癌藥物和其他藥物候選物。

與其他細(xì)胞系一樣，H-4-II-E細(xì)胞系雖然具有一定的代表性，但并不能完全模擬真實(shí)的人體環(huán)境。因此，在將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床之前，還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究。

H-4-II-E

H-4-II-E細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇H-4-II-E細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)H-4-II-E細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)H-4-II-E細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

H-4-II-E細(xì)胞可以用于miR-200a在抑制成體肝干細(xì)胞惡性表型和功能中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究

明確miR-200a在肝卵圓細(xì)胞系WB-F344及肝癌細(xì)胞系（BRL、H-4-II-E細(xì)胞，CBRH-7919，RH-35）中的表達(dá)水平，進(jìn)而研究miR-200a外源性功能抑制對(duì)WB-F344細(xì)胞表型及功能的影響，最后探討miR-200a調(diào)控WB-F344細(xì)胞表型及功能的具體分子機(jī)制。

【方法】1.分別選擇大鼠肝卵圓細(xì)胞系WB-F344，大鼠正常肝上皮細(xì)胞系BRL以及大鼠肝癌細(xì)胞系H-4-II-E細(xì)胞，CBRH-7919，RH-35，利用qRT-PCR方法檢測miR-200a在BRL、H-4-II-E細(xì)胞，CBRH-7919，RH-35中的表達(dá)水平，明確miR-200a在肝癌發(fā)生中的表達(dá)變化。

2. 構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的miR-200a功能穩(wěn)定抑制細(xì)胞系WB-anti-miR-200a及對(duì)照細(xì)胞系（BRL、H-4-II-E細(xì)胞，CBRH-7919，RH-35）WB-miR-NC，分別從miRNA水平、mRNA水平及蛋白水平進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率及功能鑒定。

3. 檢測WB-anti-miR-200a細(xì)胞中HCSC相關(guān)表型及功能：具體包括生長增殖能力及自我更新能力（細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、懸浮培養(yǎng)克隆球形成實(shí)驗(yàn)）；凋亡水平變化（FITC-Annexin V-PI染色、Caspase3/7活性檢測）；HCSC標(biāo)志物表達(dá)及肝系分化情況（qRT-PCR方法檢測EpCAM、CD133、ABCG2、CK19、AFP、ALB等分子）；細(xì)胞耐藥能力（流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞與化療藥物共培養(yǎng)后凋亡水平）；體內(nèi)致瘤能力（裸鼠皮下成瘤檢測）。

4. 鑒定WB-anti-miR-200a細(xì)胞的EMT特征：光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力；western-blot方法檢測E-cadherin、Vimentin、N-cadherin等EMT特征蛋白表達(dá)。

【結(jié)果】1.相對(duì)于WB-F344細(xì)胞及BRL細(xì)胞，miR-200a在3種H-4-II-E細(xì)胞，CBRH-7919，RH-35中的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。

參考文獻(xiàn)

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