背景^[1-3]

胰臟星狀細(xì)胞（Pancreatic Stellate Cells，胰臟星狀細(xì)胞）是胰腺中的一種特殊細(xì)胞類型，在胰腺纖維化的過(guò)程中扮演著重要角色。胰臟星狀細(xì)胞被證實(shí)與胰腺纖維化有著密切的關(guān)聯(lián)，它們的活化是導(dǎo)致胰腺纖維化的中心環(huán)節(jié)。

在健康狀態(tài)下，胰臟星狀細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的合成和降解來(lái)維持胰腺的正常組織結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)胰腺受到損傷或炎癥的影響時(shí)，胰臟星狀細(xì)胞會(huì)從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，此時(shí)的它們會(huì)表現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)，并大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分。這導(dǎo)致了胰腺腺泡周圍結(jié)締組織的大量增生，即胰腺纖維化。

此外，胰臟星狀細(xì)胞還被發(fā)現(xiàn)具有其他多種功能，如作為前體細(xì)胞、免疫細(xì)胞和胰腺外分泌介質(zhì)細(xì)胞等。在胰腺癌細(xì)胞的存在下，胰臟星狀細(xì)胞還被證實(shí)與其存在緊密的聯(lián)系，有助于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

目前，胰臟星狀細(xì)胞已成為研究胰腺纖維化、慢性胰腺炎和胰腺癌等疾病的重要靶點(diǎn)。針對(duì)胰臟星狀細(xì)胞的活化或抑制因素的研究，以及通過(guò)調(diào)節(jié)胰臟星狀細(xì)胞的功能來(lái)逆轉(zhuǎn)胰腺纖維化的可能性，都是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

胰臟星狀細(xì)胞

胰臟星狀細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇胰臟星狀細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)胰臟星狀細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)胰臟星狀細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

胰臟星狀細(xì)胞可以用于Hic-5通過(guò)NF-κB（p65）/IL-6信號(hào)通路參與調(diào)控慢性胰腺炎的機(jī)制研究

從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)層面研究胰臟星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells,PSCs)中Hic-5對(duì)慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的影響,并探索其對(duì)下游通路的表達(dá)調(diào)控。探討CP新的治療靶點(diǎn),為CP的治療提供新的方法和可能的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

方法:1.對(duì)人胰腺組織進(jìn)行H&E染色、免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hic-5在CP患者中的表達(dá)情況。

2. 以隨機(jī)數(shù)表法將8-12周齡大小的野生型(wild type,WT)和Hic-5敲除(knock out,KO)C57BL/6雄性小鼠分為對(duì)照組和模型組,每組5只,共四組。模型組以雨蛙素腹膜內(nèi)注射誘導(dǎo)CP小鼠模型。在動(dòng)物層面分析Hic-5對(duì)CP的影響。通過(guò)H&E染色、Masson三色染色和天狼星紅染色分析小鼠胰腺纖維化情況。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化、WB和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcription and quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)等方法檢測(cè)小鼠炎性因子、纖維化相關(guān)指標(biāo)和下游通路的變化情況。

3. 分別以膠原酶消化法和密度梯度離心法分離WT和Hic-5 KO小鼠中胰腺腺泡細(xì)胞及胰臟星狀細(xì)胞。在細(xì)胞層面分析Hic-5的表達(dá)情況及對(duì)PSCs活化的影響。以WB法檢測(cè)Hic-5在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hic-5對(duì)胰臟星狀細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞遷移能力的影響。

4. 予不同濃度的雷公藤甲素(NF-κB/p65抑制劑)處理原代PSCs,在細(xì)胞層面分析NF-κB/p65對(duì)PSCs活化的影響。通過(guò)胰臟星狀細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB/p65抑制后對(duì)細(xì)胞增殖能力和遷移能力的影響。

參考文獻(xiàn)

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