背景^[1-3]

MDA-MB-231是一種源自人類乳腺癌的細(xì)胞系，常被用作生物醫(yī)學(xué)研究的模型系統(tǒng)。這種細(xì)胞系具有侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移和耐藥等特點(diǎn)，因此在癌癥生物學(xué)、藥物篩選和臨床前研究中具有廣泛的應(yīng)用價值。

MDA-MB-231細(xì)胞系是通過將乳腺癌患者的胸腔積液中的癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)而得到的。這些細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)，生長迅速，并且能夠在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。此外，MDA-MB-231細(xì)胞系還具有多種生物學(xué)特性，如高表達(dá)HER2/neu基因、產(chǎn)生多種生長因子和蛋白酶等，這些特性使得它成為研究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的理想模型。

在研究中，MDA-MB-231細(xì)胞系常被用于模擬乳腺癌的生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和耐藥等。此外，該細(xì)胞系也被廣泛用于藥物篩選和臨床前研究，以評估藥物對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用和潛在療效。例如，有研究表明，某些中藥成分可以通過抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡來發(fā)揮抗癌作用。

然而，需要注意的是，雖然MDA-MB-231細(xì)胞系具有一定的代表性，但并不能完全模擬真實(shí)的人體環(huán)境。因此，在將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床之前，仍需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究。此外，MDA-MB-231細(xì)胞系的培養(yǎng)和傳代也需要特定的條件和方法，以確保細(xì)胞的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

MDA-MB-231

MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇MDA-MB-231細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)MDA-MB-231細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)MDA-MB-231細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

MDA-MB-231可以用于苦參堿聯(lián)合多西他賽促進(jìn)三陰性人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中探索苦參堿和多西他賽聯(lián)合使用對細(xì)胞增殖和凋亡等的影響;在此基礎(chǔ)上利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)研究苦參堿聯(lián)合多西他賽抗人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的進(jìn)一步分子機(jī)制,并進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

方法1.通過CCK-8、克隆形成、Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)探索不同濃度的苦參堿和多西他賽單藥及聯(lián)合用藥對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響,在此基礎(chǔ)上選取苦參堿(1mM)、多西他賽(10nM)和聯(lián)合用藥(苦參堿1mM+多西他賽10nM)等模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡等作用。用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測上述用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Caspase和Bcl-2家族相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

2. 利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)研究苦參堿聯(lián)合多西他賽抗人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的靶分子,并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。質(zhì)粒過表達(dá)該分子后,采用聯(lián)合用藥的處理模式檢驗(yàn)靶分子過表達(dá)后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞表型和Caspase家族相關(guān)蛋白質(zhì)變化情況。

3. 建立人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞BALB/c裸鼠移植瘤模型,待腫瘤體積達(dá)到約100mm3時,將裸鼠隨機(jī)分為如下4組,每組8只,并進(jìn)行如下處理:①對照組(Control):等體積的生理鹽水,腹腔注射,5次/周,共計(jì)15次。②苦參堿組(Mat):苦參堿500mg/kg,腹腔注射,5次/周,共計(jì)15次。③多西他賽組(Doc):多西他賽8mg/kg,腹腔注射,1次/周,共計(jì)3次。④聯(lián)合組(Comb):苦參堿+多西他賽(苦參堿50mg/kg,腹腔注射,5次/周,共計(jì)15次;多西他賽8mg/kg,腹腔注射,1次/周,共計(jì)3次)。研究過程中觀察各組荷瘤裸鼠的一般情況,測量裸鼠體重、腫瘤體積等指標(biāo)。達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后采血后送檢血常規(guī)、肝功能,脫頸處死裸鼠,剝離裸鼠腫瘤,拍照記錄并測量腫瘤組織質(zhì)量。分別進(jìn)行腫瘤組織的HE染色、Tunel染色及相關(guān)蛋白的免疫組化檢測。

結(jié)果1.苦參堿和多西他賽單藥均呈一定程度的濃度及時間依賴性的方式抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡能力,兩藥聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí):苦參堿和多西他賽單藥作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后,Cleaved-caspase-3、-8、-9及Bax等促凋亡蛋白表達(dá)均有所上調(diào),而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)有所下降,兩藥聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。

2. 蛋白組學(xué)分析提示HN1是苦參堿處理人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后的下調(diào)蛋白之一(Fold change:0.61);苦參堿聯(lián)合多西他賽的用藥模式對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡能力可被過表達(dá)HN1所抵消。

3. 苦參堿與多西他賽的聯(lián)合用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積和瘤重的抑制起到協(xié)同作用,免疫組化檢測提示聯(lián)合用藥的給藥模式在抑制腫瘤組織中CD31、VEGF、Cleaved-caspase-3、HN1的表達(dá)方面具有協(xié)同作用,并且這種用藥模式對裸鼠的一般狀況、體重、肝功能和血常規(guī)均無明顯影響。

結(jié)論苦參堿(1mM)聯(lián)合多西他賽(10nM)的用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抗腫瘤作用具有協(xié)同作用,該作用可能是通過下調(diào)HN1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的?？鄥A與多西他賽的聯(lián)合用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積和瘤重的抑制起到協(xié)同作用,且對裸鼠的一般狀況、體重、肝功能和血常規(guī)均無明顯影響。

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