背景^[1-7]

穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建是將外源質(zhì)粒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的蛋白，稱穩(wěn)定細(xì)胞系。高質(zhì)量的穩(wěn)定細(xì)胞系在生物學(xué)研究中扮演著非常重要的角色，包括基因功能研究、重組抗體、藥物開發(fā)等。

技術(shù)原理：

1. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，單克隆篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞種到96孔板，保證每個(gè)孔2-3個(gè)細(xì)胞，這樣才能得到單克隆。待細(xì)胞貼壁后，加入抗生素篩選。篩選時(shí)間和濃度視細(xì)胞而定。一般G418一個(gè)星期作用，嘌呤霉素2-3天。脂質(zhì)體法篩單克隆時(shí)間較長，且效率低，大概只有1%。

2.逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

病毒轉(zhuǎn)染：先要用包裝細(xì)胞，一般為293細(xì)胞，包裝出病毒，再用病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。包裝病毒視不同類型的病毒而定，一般要3-5天的時(shí)間。包裝好的病毒要測滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的病毒量。轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。病毒轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率高，只是步驟繁瑣。

技術(shù)流程：

1. 載體構(gòu)建-目的基因過表達(dá)載體的構(gòu)建。

2. 病毒包裝-表達(dá)載體、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集病毒上清，純化和濃縮病毒顆粒。若選擇轉(zhuǎn)染，則跳過此步。

3. 轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)-電轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體等）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

4. 篩選-根據(jù)表達(dá)載體的篩選基因選擇藥物進(jìn)行篩選，如嘌呤霉素、G418等

5. 擴(kuò)大培養(yǎng)-將篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

6. 鑒定-PCR、Q-PCR、western等從DNA、mRNA、蛋白水平進(jìn)行檢測。

應(yīng)用^[8][9]

1.用于基因功能研究

在H5N1型禽流感NS1基因在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建的研究中將H5N1型禽流感病毒NS1(non-structural protein 1)基因插入pEGFP-N1真核表達(dá)載體中,獲得重組質(zhì)粒pNS1-EGFP,經(jīng)酶切鑒定并測序后,去內(nèi)毒素提取pNS1-EGFP質(zhì)粒,在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑作用下將pNS1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,利用倒置熒光顯微鏡、FCM和Western blot 3種方法檢測NS1-EGFP融合蛋白的表達(dá),利用極限稀釋的方法獲取單細(xì)胞,并利用G418抗性篩選獲取穩(wěn)定細(xì)胞系。

結(jié)果顯示,NS1基因正確插入pEGFP-N1真核表達(dá)載體,NS1-EGFP融合蛋白讀碼框架正確;3種檢測方法表明,NS1-EGFP融合蛋白在HEK293細(xì)胞中能夠表達(dá);pEGFP-N1和NS1-EGFP穩(wěn)定細(xì)胞系流式細(xì)胞儀檢測,陽性率分別為95.74%和96.10%,Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),HEK293空白細(xì)胞和pEGFP-N1穩(wěn)定細(xì)胞系未見任何條帶,NS1-EGFP穩(wěn)定細(xì)胞系在51 000處見特異性條帶,綜上說明穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2. 重組蛋白開發(fā)

在白細(xì)胞介素-35慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)A549細(xì)胞系的建立的實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建過表達(dá)白細(xì)胞介素（IL）-35的慢病毒載體,包裝慢病毒并感染肺癌細(xì)胞A549建立過表達(dá)IL-35的A549穩(wěn)定細(xì)胞株,為研究IL-35在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

方法根據(jù)基因序列及所用載體序列設(shè)計(jì)用于無縫克隆的引物序列,用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增IL-35基因,EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切PCR產(chǎn)物及載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro,經(jīng)載體重組、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定和測序鑒定等獲得重組質(zhì)粒。將篩選出的重組慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,收取病毒濃縮液并檢測其滴度。病毒濃縮液感染A549細(xì)胞,用Real-time PCR和Western blot方法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中IL-35的表達(dá)。

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