背景^[1-3]

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是指大鼠肝臟中的主要功能細(xì)胞，也稱為肝細(xì)胞。這些細(xì)胞占據(jù)了肝臟的大部分體積，并承擔(dān)著多種重要的生理功能，包括代謝、解毒、合成和分泌等。

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室研究中常被用作模型來(lái)探討肝臟疾病、藥物代謝和毒理學(xué)等方面的問(wèn)題。它們可以通過(guò)原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的方式獲得，并用于各種體外實(shí)驗(yàn)。

原代培養(yǎng)是指從大鼠肝臟中直接分離出肝細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法可以保持細(xì)胞的原始特性，但細(xì)胞壽命相對(duì)較短，通常只能進(jìn)行有限次數(shù)的傳代。傳代培養(yǎng)則是將原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增，使其能夠在實(shí)驗(yàn)室中長(zhǎng)期保存并進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)。然而，傳代培養(yǎng)的大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)逐漸失去某些原始特性。

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中需要特定的培養(yǎng)基和條件來(lái)維持其生長(zhǎng)和功能。通常，這些細(xì)胞需要在含有適當(dāng)比例的胎牛血清（FBS）、抗生素和生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境也需要保持恒定的溫度、濕度和二氧化碳濃度。

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有多種功能，包括合成和分泌蛋白質(zhì)、代謝碳水化合物、脂肪和藥物等。因此，它們常被用于研究肝臟的代謝途徑、藥物代謝和毒理學(xué)等方面。此外，這些細(xì)胞還可以用于評(píng)估藥物對(duì)肝臟的潛在毒性以及開(kāi)發(fā)新的治療策略。

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以用于葡萄糖對(duì)大鼠肝細(xì)胞白蛋白基因表達(dá)的影響

首先觀察大鼠Kupffer細(xì)胞與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞體外共同培養(yǎng)時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)及功能狀況,建立實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。進(jìn)一步觀察不同濃度葡萄糖對(duì)大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞白蛋白基因表達(dá)的影響。

方法(1)原位二步Ⅳ型膠原酶灌注法聯(lián)合Percoll液密度梯度離心法分離肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞;體外進(jìn)行肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞按6:1比例共同培養(yǎng),觀察不同情況下肝細(xì)胞生存時(shí)間和形態(tài),每隔24h檢測(cè)培養(yǎng)上清中白蛋白和ALT、AST的水平,并在36h放免法檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量。

(2) 用終濃度分別為3.9mmol/L,7.0mmol/L,11.1mmol/L,22.2mmol/L的葡萄糖處理聯(lián)合培養(yǎng)體系,以3.9mmol/L組作為對(duì)照組,分別于4h、24h留取細(xì)胞上清液,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)白蛋白濃度,放免法檢測(cè)上清液TNF-α、IL-1、IL-6含量,提取大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞RNA及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(RT-PCR)檢測(cè)白蛋白mRNA含量。

結(jié)果(1)單獨(dú)培養(yǎng)組大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖迅速,并向正常肝細(xì)胞的形態(tài)演變,肝細(xì)胞可培養(yǎng)存活至15d;共同培養(yǎng)組肝細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)增殖緩慢,細(xì)胞可培養(yǎng)存活至10d?；旌吓囵B(yǎng)組上清白蛋白水平在24、36、48、60h比單獨(dú)培養(yǎng)組低(t=2.980,3.139,2.551,2.605;p<0.05);混合培養(yǎng)組上清ALT、AST水平在24、36、48、60h高于于單獨(dú)培養(yǎng)組(ALT t=3.055,2.666,2.824,3.108;p<0.05;AST t=2.632,2.446,3.090,2.895;p<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組Kupffer細(xì)胞保持IL-1、IL-6和TNF-α分泌功能,而單獨(dú)培養(yǎng)組未檢測(cè)到IL-1、IL-6和TNF-α。

(3) 不同濃度葡萄糖處理大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞4h后,各組肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與此同時(shí),各組肝細(xì)胞上清中白蛋白水平與肝細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比下降不明顯;而培養(yǎng)24h以后,各組肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平與對(duì)照組相比上升明顯,并且,隨著葡萄糖濃度的增加肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF濃度不斷上升,并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,各組肝細(xì)胞上清中白蛋白水平與肝細(xì)胞白蛋白mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比下降明顯,呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,與肝細(xì)胞上清中IL-1,IL-6,TNF水平變化一致。

結(jié)論(1)大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下可進(jìn)行共同培養(yǎng),kupffer細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能和肝細(xì)胞白蛋白合成分泌功能保持良好,可用于實(shí)驗(yàn)研究。(2)高濃度葡萄糖糖能促進(jìn)Kupffer細(xì)胞釋放IL-1、IL-6和TNF-α,間接抑制大鼠肝細(xì)胞白蛋白mRNA的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]Changes in the Serum Proteome of Patients with Sepsis and Septic Shock[J].Armin Kalenka;;Robert E.Feldmann;;Kevin Otero;;Martin H.Maurer;;Klaus F.Waschke;;Fritz Fiedler.Anesthesia&Analgesia,2006(6)

[2]Ovarian enzyme activities in women with polycystic ovary syndrome[J].Denis A.Magoffin.Fertility and Sterility,2006

[3]The NF-κB inhibitors attenuate hepatic injury in bile duct ligated rats[J]..Pediatric Surgery International,2006(8)

[4]The solution structure of the membrane-proximal cytokine receptor domain of the human interleukin-6 receptor[J].Oliver Hecht;;Andrew J.Dingley;;Andreas Schwanter;;Suat?zbek;;Stefan Rose-John;;Joachim Gr?tzinger.Biological Chemistry,2006(9)

[5]曹成波.葡萄糖對(duì)大鼠肝細(xì)胞白蛋白基因表達(dá)的影響[D].青島大學(xué),2009.