背景^[1-3]

PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）是一種用于科研實驗的細(xì)胞類型，具有貼壁生長的特性，形態(tài)為內(nèi)皮細(xì)胞樣，短梭形。這種細(xì)胞來源于大鼠的肺微血管，通常用于研究肺部的生理和病理過程，如血管通透性、炎癥反應(yīng)、氣體交換等。

在實驗室中，PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）可以通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行擴(kuò)增和傳代。細(xì)胞培養(yǎng)需要特定的培養(yǎng)基和條件，以保證細(xì)胞的正常生長和繁殖。復(fù)蘇細(xì)胞時，通常將凍存的細(xì)胞在37℃水浴中迅速解凍，并與培養(yǎng)基混合均勻，然后進(jìn)行離心、洗滌和重新懸浮，最后加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）

PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的規(guī)格通常以細(xì)胞數(shù)量來表示，如每瓶或每管包含多少細(xì)胞。價格則因品牌、質(zhì)量和數(shù)量等因素而異。在購買PMVEC時，需要注意選擇正規(guī)渠道和有質(zhì)量保證的產(chǎn)品，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）可以用于肝細(xì)胞來源的miR-194激活PMVEC促進(jìn)血管生成在肝肺綜合征中的作用及機制

選擇果蠅卵室發(fā)育過程中發(fā)生群體細(xì)胞遷移的邊界細(xì)胞團(tuán)作為研究對象,開展相關(guān)研究,以期發(fā)現(xiàn)其中的一些共性,更好的闡明肝肺綜合征血管新生過程的具體機制。

研究方法:1.構(gòu)建HPS大鼠模型,提取并鑒定血清外泌體,觀察PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）對其的吸收情況構(gòu)建運用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,5周后進(jìn)行血氣、肝功、血流動力學(xué)測定以及肝肺組織病理切片分析,取假手術(shù)組和HPS組大鼠外周動脈血血清運用差速離心法提取外泌體,運用Western blot、TEM和NTA法鑒定外泌體,再用BCA測定外泌體濃度變化。最后,運用PKH67標(biāo)記外泌體,與PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）共培養(yǎng),觀察對外泌體的吸收情況。

2. 觀察血清外泌體對PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）增殖、遷移及成管的影響將血清外泌體與PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）共培養(yǎng),通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及增殖情況;運用Transwell小室實驗和劃痕試驗觀察PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。

3. 利用miRNA生物芯片篩查外泌體miRNA差異表達(dá)譜,并進(jìn)行qRT-PCR驗證對大鼠外周血血清外泌體進(jìn)行miRNA生物芯片篩查,得到差異表達(dá)的miRNA,運用qRT-PCR進(jìn)行驗證。

4. 觀察miR-194對PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）增殖、遷移及成管的影響將miR-194激動劑和抑制劑轉(zhuǎn)染PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）,通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及增殖情況;運用Transwell小室實驗和劃痕試驗觀察PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。

5. 生物信息學(xué)分析并驗證潛在的miR-194靶基因運用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-194的靶基因,運用Amigo數(shù)據(jù)庫搜集負(fù)調(diào)控血管生成的基因,取兩組數(shù)據(jù)的交集,得到miR-194潛在的調(diào)控血管生成的靶基因,運用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行驗證。

6. 分析HPS時血清中增加的外泌體的分泌細(xì)胞對可能導(dǎo)致血清外泌體和外泌體內(nèi)miR-194增加的細(xì)胞進(jìn)行篩查,并模擬體內(nèi)條件運用膽汁酸刺激篩查出的細(xì)胞,觀察其分泌外泌體和miR-194的變化.

7. 在體和離體水平驗證肝細(xì)胞內(nèi)P53通路介導(dǎo)的外泌體分泌在HPS血管生成中作用運用P53抑制劑pifithrin-μ、P53 RNAi探討P53對膽汁酸處理后肝細(xì)胞中TASP6表達(dá)、培養(yǎng)基里外泌體濃度以及外泌體miR-194含量的影響。CBDL模型大鼠靜脈注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194,觀察其對肺血管生成及存活率的影響。進(jìn)一步分析了HPS患者和大鼠血清胞外泌體miR-194水平和P(A-a)O2的相關(guān)性。

8. 在果蠅卵室內(nèi)利用活體成像和光遺傳學(xué)技術(shù),觀察Myo-II流動在群體細(xì)胞遷移中的具體作用結(jié)果:1.成功構(gòu)建運用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,并從外周血清中提取出外泌體,發(fā)現(xiàn)肝肺綜合征大鼠血清外泌體濃度存在顯著改變,PKH-67標(biāo)記的血清外泌體可以被PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）吸收。

2. 來源于肝肺綜合征大鼠血清的外泌體可以顯著促進(jìn)PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的增殖、遷移及成管效應(yīng)。

3. miRNA生物芯片及qRT-PCR驗證結(jié)果提示miR-194在肝肺綜合征大鼠血清的外泌體內(nèi)表達(dá)顯著升高。

4.miR-194可以顯著促進(jìn)PMVEC（大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）的增殖、遷移及成管效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

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