羧肽酶B(簡稱CPB)是一種含鋅的胰外肽酶。CPB含307個氨基酸，分子質(zhì)量35ku。由于CPB特異的水解肽鏈C端的堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸或鳥氨酸)，所以其可用于蛋白質(zhì)和多肽的序列分析，特別是用來確定羧基端氨基酸。此外，目前CPB的主要商業(yè)用途是作為工業(yè)用酶應(yīng)用于胰島素的工業(yè)生產(chǎn)。

制備方法

CN1990861A目的在于，提供一種通過直接表達(dá)CPB來制備活性CPB的方法，以此克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟繁瑣之缺陷。

本發(fā)明所說的活性羧肽酶B(CPB)的制備方法，其主要步驟為：首先經(jīng)上清表達(dá)或包涵體表達(dá)帶CPB的DNA的重組菌株，然后經(jīng)分離得到活性CPB，其特征在于，所述重組菌株的質(zhì)粒為pT7-473-CPB，宿主為E coli BL21(DE3)(BL21(DE3)：F-，ompT，HsdSB，(rB -，mB -)，dcm，gal，λ(DE3)購自invitrogen公司。

本發(fā)明所說的質(zhì)粒(pT7-473-CPB)的構(gòu)建：在pT7-473(來源于pET-21a(invitrogen出品)，增加多克隆位點后命名，增加多克隆位點的方法(參照Molecular Cloning：A LaboratoryManual 2nd ed(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的多克隆位點NdeI和HindIII之間插入CPB的編碼DNA片段，該質(zhì)粒為T7啟動子，含Lac調(diào)節(jié)元件，氨芐抗性。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

其中：CPB的DNA片段來源于已構(gòu)建的質(zhì)粒pT7-473-proCPB，proCPB核苷酸序列來源于RT-PCR技術(shù)獲得的大鼠胰腺proCPB RNA序列(Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)：1-10)。

本發(fā)明實現(xiàn)了通過直接表達(dá)CPB來制備活性CPB的目的，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟冗雜之缺陷。