背景^[1-3]

大鼠支氣管上皮細胞是構(gòu)成大鼠呼吸道的重要組成部分，主要位于支氣管內(nèi)壁。這些細胞在維持呼吸道功能、防止病原體入侵以及參與氣道免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

在生物醫(yī)學研究中，大鼠支氣管上皮細胞被廣泛用于模擬和研究人類支氣管上皮細胞的生物學特性、功能以及疾病發(fā)生機制。這些細胞可以用于研究呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等呼吸道疾病的發(fā)病機制和治療方法。

為了獲取大鼠支氣管上皮細胞，研究人員通常需要通過特定的方法從大鼠的支氣管組織中分離和培養(yǎng)這些細胞。培養(yǎng)過程需要特定的培養(yǎng)基和條件，以確保細胞的生長和活性。

在實驗室環(huán)境中，大鼠支氣管上皮細胞的培養(yǎng)和實驗操作需要遵守嚴格的無菌操作和細胞培養(yǎng)規(guī)范，以確保細胞的純度和實驗結(jié)果的可靠性。

大鼠支氣管上皮細胞

大鼠支氣管上皮細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠支氣管上皮細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)大鼠支氣管上皮細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠支氣管上皮細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠支氣管上皮細胞可以用于PERK/eIF2α通路負調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抵抗COPD氣道上皮細胞凋亡的機制研究

體外研究發(fā)現(xiàn)在PERK/eIF2a這條通路被敲除后,細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡敏感性增加,而增強PERK/eIF2a通路,細胞凋亡減少,證明上調(diào)PERK通路在ERS中具有對抗細胞凋亡的作用。基于目前在COPD發(fā)病中,PERK/eIF2a通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中如何作用,其與CHOP、caspase關(guān)系尚不明確,擬以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)大鼠支氣管上皮細胞(HBE)為主要模型,探討PERK通路相關(guān)信號分子、凋亡信號指標及之間關(guān)系,研究PERK通路的活化劑salubrinal在其中的作用,旨在證實PERK通路在COPD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中具有重要作用,為臨床治療COPD提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點。

PERK/eIF2a通路在COPD大鼠支氣管上皮細胞大鼠支氣管肺組織中凋亡中的作用目的：觀察PERK通路在COPD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致支氣管肺組織是否活化及salubrinal對香煙煙霧所致氣道上皮細胞凋亡的影響。

方法：36只Wistar大鼠隨機均分為3組：正常對照組、COPD模型組、COPD模型加藥物組(簡稱干預(yù)組)。采用被動吸煙加氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型,藥物組在滴注脂多糖的同時氣管內(nèi)滴注salubrinal(1mg/kg)。造模完成后,測定各組大鼠的肺功能；觀察肺組織病理學變化；大鼠支氣管上皮細胞免疫組化檢測p-PERK、p-eIF2a、caspase-12在支氣管肺組織中的表達和分布；western blot檢測p-PERK、p-eIF2α、active caspase-12和active caspase-3蛋白水平；TUNEL法檢測支氣管肺組織上皮細胞凋亡。

結(jié)果：模型組的各項肺功能指標較正常組均明顯降低,但以salubrinal干預(yù)后大鼠各項肺功能指標較于模型組有明顯升高。在模型組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的指標p-PERK、p-eIF2a較正常組相比增高,而干預(yù)組的p-eIF2a的表達水平最高；模型組的大鼠支氣管上皮細胞凋亡指標active caspase-12和active caspase-3表達較正常組明顯升高,干預(yù)組凋亡較模型組減少。

參考文獻

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