背景^[1-3]

大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成大鼠膀胱壁的主要細(xì)胞類型之一。這些細(xì)胞屬于平滑肌細(xì)胞家族，具有收縮和舒張的能力，從而控制尿液在膀胱中的儲(chǔ)存和排放。

在生物醫(yī)學(xué)研究中，大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞被廣泛用于模擬和研究人體膀胱平滑肌細(xì)胞的行為和功能。它們可以用于研究膀胱活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制、平滑肌細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，以及平滑肌相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

此外，大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞還被用作藥物篩選的模型，以評估新藥物對平滑肌細(xì)胞的影響和潛在的治療作用。這些細(xì)胞也可以用于細(xì)胞治療研究，如細(xì)胞移植和組織工程等，以修復(fù)受損的膀胱平滑肌組織或促進(jìn)膀胱再生。

大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞

大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞可以用于細(xì)胞間接觸在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化中作用的實(shí)驗(yàn)研究

以SD大鼠為研究對象,分別利用密度梯度離心法和酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;模仿體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境,建立Rat Bladder Smooth Muscle Cells大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)變化;在共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上阻斷細(xì)胞間縫隙連接,檢測抑制細(xì)胞間連接后對BMSCs向SMCs分化情況的影響。

主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定1.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨,沖出骨髓,采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,DMEM-12培養(yǎng),獲得貼壁細(xì)胞,監(jiān)測細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測其免疫表型,采用不同條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向成脂、成骨分化。和生長情況。

結(jié)果:分離的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)后呈紡錘體樣,其分子免疫表型為:CD44、CD90陽性;CD31、CD45陰性。在不同的誘導(dǎo)條件下,BMSCs可形成脂滴、骨結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu),成功分離并培養(yǎng)了BMSCs。2.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱,采用胰酶消化法分離單個(gè)核細(xì)胞,HG-DMEM培養(yǎng),獲得貼壁細(xì)胞,監(jiān)測細(xì)胞生長曲線,免疫熒光法鑒定其標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果:平滑肌特異性的a-SMA,Calponin和SM-MHC表達(dá)陽性,證實(shí)分離并培養(yǎng)了膀胱平滑肌細(xì)胞。

二、大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型的建立與鑒定1.建立大鼠BSMCs誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標(biāo)志蛋白表達(dá)變化。以懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs之間的間隔,細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,膠原等物質(zhì)可通過膜上的孔相流通,多孔膜上下兩面的細(xì)胞可通過膜上的孔進(jìn)行細(xì)胞間接觸,但細(xì)胞不能通過。將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔膜兩側(cè)作為接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組,將大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞接種于多孔膜上,BSMCs接種于六孔板底,使得兩種細(xì)胞仍處在一個(gè)培養(yǎng)環(huán)境中,之間距離<900μm,兩種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子仍可以通過多孔膜膜孔相互影響,但是不發(fā)生接觸作為非接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組,以單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs作為對照組,在共培養(yǎng)的第4天和第8天的免疫熒光法和Western blot法檢測BMSCs中平滑肌特異性蛋白的表達(dá)情況,在共培養(yǎng)1,2,3天檢測實(shí)驗(yàn)組中BMSCs的平滑肌特異性蛋白基因的表達(dá)情況。

結(jié)果:免疫熒光法、Western blot法和qRT-PCR均顯示隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長,接觸組的BMSCs中SMC特異的蛋白的表達(dá)量增加,而非接觸組與共培養(yǎng)前無明顯變化,提示細(xì)胞間的接觸在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。

2.正庚醇阻斷細(xì)胞間縫隙連接對大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞向SMCs分化的影響。初步實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞間接觸共培養(yǎng)可以很好的誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化,正庚醇阻斷縫隙連接后可以有明顯的抑制BMSCs向SMCs分化,進(jìn)一步證明縫隙連接在在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering[J].Peerani,Raheem;Zandstra,Peter W.Journal of Clinical Investigation,2010(1)

[2]In vitro Myogenic Differentiation of Human Bone Marrow–Derived Mesenchymal Stem Cells as a Potential Treatment for Urethral Sphincter Muscle Repair[J]..Annals of the New York Academy of Sciences,2009(1)

[3]Mimicking stem cell niches to increase stem cell expansion[J].Shara M Dellatore;;A Sofia Garcia;;William M Miller.Current Opinion in Biotechnology,2008(5)

[4]Stem Cells and Niches:Mechanisms That Promote Stem Cell Maintenance throughout Life[J].Sean J.Morrison;;Allan C.Spradling.Cell,2008(4)

[5]劉曉芳.細(xì)胞間接觸在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].第三軍醫(yī)大學(xué),2011.