背景^[1-3]

NRK是一種來源于正常大鼠腎臟的細胞系，常用于研究腎臟生物學(xué)、藥物篩選、毒性測試以及病毒學(xué)研究。NRK細胞系具有以下特點：

來源：NRK細胞系是從正常大鼠腎臟組織中建立的，通過多次傳代培養(yǎng)而形成穩(wěn)定的細胞系。

形態(tài)特征：NRK細胞通常呈現(xiàn)成纖維細胞樣的形態(tài)，呈梭形或多角形，細胞大小和形態(tài)可能會根據(jù)培養(yǎng)條件和細胞密度而有所變化。

生長特性：NRK細胞在適宜的培養(yǎng)條件下（如含有適量胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）可以穩(wěn)定生長，具有較快的增殖速率。

應(yīng)用：由于NRK細胞來源于正常的腎臟組織，它們常用于研究腎臟細胞的生理和病理過程，以及作為體外模型來評估藥物的腎臟毒性。此外，NRK細胞也被用于研究病毒感染，尤其是那些能夠感染腎臟細胞的病毒。

變異株：NRK細胞系有幾個亞型，如NRK-49F和NRK-52E，這些亞型可能具有不同的特性和應(yīng)用領(lǐng)域。

優(yōu)勢：NRK細胞系的優(yōu)勢在于它們相對容易培養(yǎng)，生長迅速，且能夠代表正常腎臟細胞的特性，這使得它們成為研究腎臟相關(guān)疾病的理想模型。

NRK

NRK細胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇NRK細胞系：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)NRK細胞系傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)NRK細胞系凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

NRK可以用于腫瘤相關(guān)成纖維細胞NRK促進肺腺癌遷移侵襲作用及機制研究

腫瘤相關(guān)成纖維細胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)中的主要成分。靶向CAFs治療已成為腫瘤治療中一種有前景的治療方式。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序、綜合生物信息學(xué)分析以及細胞、臨床標本檢測,我們發(fā)現(xiàn)CAFs高表達NRK(Nik-related kinase),并且我們進一步探究CAFs高表達NRK對肺腺癌細胞遷移侵襲的作用及相關(guān)機制,為靶向CAFs治療提供新的潛在靶點。

方法:1.收集肺腺癌新鮮手術(shù)標本,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法,分離CAFs、正常肺成纖維細胞(Normal Fibroblasts,NFs)。光學(xué)顯微鏡觀察CAFs、NFs形態(tài)、蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)和免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測成纖維細胞標記物的表達,鑒定成纖維細胞。

2. 收集培養(yǎng)CAFs、NFs細胞72小時后的無血清DMEM培養(yǎng)基,離心后取上清,得到CAF條件培養(yǎng)基(Cancer associated fibroblasts conditional medium,CAF-CM)和NFs條件培養(yǎng)基(Normal fibroblasts conditional medium,NF-CM)。檢測CAF-CM、NF-CM對肺腺癌細胞(A549和H1299)增殖、侵襲、遷移的影響。

3. 根據(jù)我們本次CAFs測序數(shù)據(jù)集,結(jié)合課題組前期CAFs基因芯片數(shù)據(jù)集,以及Array Express公共數(shù)據(jù)庫肺腺癌CAFs差異基因數(shù)據(jù)集,通過韋恩圖,尋找這三個數(shù)據(jù)集差異倍數(shù)(Fold Change,FC)的絕對值大于2,校正P值小于0.05的共有差異基因。最終得到10個交集差異基因(ZNF93、ZNF827、NRK、DPYSL4、HES4、LYPD6B、SETBP1、HMCN1、FCGBP、CFI)。q RT-PCR檢測上述10個交集差異基因在CAFs的相對表達水平。q RT-PCR、WB、IF檢測CAFs中NRK的表達水平。

4. 采用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)法,檢測NRK在肺腺癌組織、癌旁組織的表達,分析NRK在肺腺癌的表達水平和臨床病理因素的關(guān)系。

5. 構(gòu)建NRK干擾慢病毒載體和過表達質(zhì)粒,在CAFs、NFs分別干擾、過表達NRK基因,q RT-PCR、WB檢測干擾或過表達NRK的效果。6.收集干擾或過表達NRK的CAFs條件培養(yǎng)基(CAF-sh NRK-CM)、NFs條件培養(yǎng)基(NF-OE-CM)。檢測CAF-sh NRK-CM、NF-OE-CM對A549、H1299細胞的遷移、侵襲的影響,ELISA檢測條件培養(yǎng)基中CXCL5的變化。

6. 劃痕法、Transwell法、WB、IF檢測干擾過或表達NRK對CAFs、NFs運動能力的影響、磷酸化Cofilin(p-Cofilin)蛋白表達水平的影響、F-actin的變化。

7. 共培養(yǎng)實驗觀察干擾NRK對CAFs引導(dǎo)A549、H1299運動的影響。

結(jié)果:1.光鏡下可見,NFs、CAFs形態(tài)相似,呈紡錘形,CAFs細胞體積較NFs更大。WB和IF結(jié)果顯示,NFs、CAFs均高表達細胞間質(zhì)標志物波形蛋白(Vimentin),不表達上皮標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)。同時成纖維細胞標志物α-SMA、FAP-α的表達在CAFs高于NFs,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2. 與NF-CM相比,CAF-CM能夠促進肺腺癌細胞(A549和H1299)增殖、遷移、侵襲,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3.通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序、綜合生物信息學(xué)分析和q RT-PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn)NRK是10個交集差異基因中,在CAFs表達顯著升高的上調(diào)差異基因,q RT-PCR、WB、IF結(jié)果顯示,NRK主要在CAFs高表達(P<0.05),IF結(jié)果提示,NRK主要定位在CAFs的細胞質(zhì)和細胞核。

參考文獻

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