背景^[1-3]

RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系是一種來源于大鼠的胰島素瘤細(xì)胞系，常用于研究胰島素分泌、胰島素抵抗、糖尿病等相關(guān)疾病。該細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)：

1.來源：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系來源于大鼠的胰島素瘤組織，經(jīng)過多次傳代和篩選，形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系。

2.形態(tài)特征：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞呈多邊形或長(zhǎng)條形，大小約為15-30微米，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁明顯。

3.生長(zhǎng)特性：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，傳代周期約為24-48小時(shí)，可在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

4.胰島素分泌功能：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞具有胰島素分泌功能，可通過刺激劑如葡萄糖、精氨酸等誘導(dǎo)胰島素分泌。

5.胰島素抵抗特性：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞具有胰島素抵抗特性，可用作研究胰島素抵抗相關(guān)疾病的模型。

6.基因表達(dá)特征：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞具有典型的胰島素瘤細(xì)胞基因表達(dá)特征，如Insulin、Glut2、Slc2a2、Slc2a4、Slc2a5、Slc2a8、Slc2a9、Slc2a10、Slc2a11、Slc2a12、Slc2a13、Slc2a14、Slc2a15、Slc2a16、Slc2a17、Slc2a18、Slc2a19、Slc2a20、Slc2a21、Slc2a22、Slc2a23、Slc2a24、Slc2a25、Slc2a26、Slc2a27、Slc2a28、Slc2a29、Slc2a30、Slc2a31、Slc2a32、Slc2a33、Slc2a34、Slc2a35、Slc2a36、Slc2a37、Slc2a38、Slc2a39、Slc2a40、Slc2a41、Slc2a42、Slc2a43、Slc2a44、Slc2a45、Slc2a46、Slc2a47、Slc2a48、Slc2a49、Slc2a50、Slc2a51、Slc2a52、Slc2a53、Slc2a54、Slc2a55、Slc2a56、Slc2a57、Slc2a58、Slc2a59、Slc2a60等基因的表達(dá)。

7. 其他特性：RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系細(xì)胞還具有一定的增殖能力，可用作研究胰島素瘤細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的模型。

RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系

RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系可以用于超極化激活環(huán)核苷酸門控的陽離子通道對(duì)RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系興奮性的調(diào)控作用

RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系源自大鼠胰島神經(jīng)內(nèi)分泌瘤,表達(dá)TPH2,能合成和分泌5-HT,被認(rèn)為是一種良好的EC細(xì)胞模型。因此本研究采用膜片鉗的方法研究HCN通道對(duì)RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系興奮性的影響,并探討炎癥因子TNF-α刺激下RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系興奮性的變化以及HCN通道在其中的作用,為闡明EC細(xì)胞的HCN2通道的生理和病理意義提供科學(xué)資料。

1. RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系電生理特征研究在電流鉗模式下記錄RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)它們的靜息膜電位介于-55-65mV(均值為-61.34mV),有趣的是,在未給予刺激的情況下,許多細(xì)胞的膜電位呈現(xiàn)出膜電位瞬變。在給予去極化電流刺激時(shí),RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系可以發(fā)放動(dòng)作電位,而且其中部分細(xì)胞可以發(fā)放連續(xù)的動(dòng)作電位,這說明RIN-14B是一種可興奮細(xì)胞,符合神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的特征。電壓依賴性鈉通道阻斷劑河豚毒素(TTX,0.1或1μM)可阻斷動(dòng)作電位的發(fā)放,而廣譜的電壓依賴性鈣通道阻斷劑CdCl2(200μM)對(duì)動(dòng)作電位并沒有影響,表明RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系的動(dòng)作電位是由鈉通道所介導(dǎo)發(fā)放的,這與文獻(xiàn)報(bào)道的腸道EC細(xì)胞的興奮性特征相一致。

2. RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系表達(dá)功能性的HCN通道在電壓鉗模式下記錄RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)在給以-10mV為階梯從予-60mV到-120mV、時(shí)程600 ms的超極化電壓刺激時(shí),可以記錄到電壓依賴性的內(nèi)向電流,而且這種電流可以被HCN通道的阻斷劑ZD 7288(1030μM)所阻斷。在電流鉗模式下記錄時(shí),當(dāng)給予細(xì)胞-140pA超極化電流刺激時(shí),細(xì)胞的膜電位會(huì)有先超極化后去極化的袋狀”sag”現(xiàn)象,這種超極化電流引起的膜電位sag可被ZD 7288所逆轉(zhuǎn)。Ivabradine是一種用于治療心動(dòng)過速型心衰的小分子藥物,其作用原理是阻斷HCN通道介導(dǎo)的起搏電流。我們發(fā)現(xiàn)Ivabradine(10100μM)能濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)超極化電流刺激RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系所引起的膜電位“sag”現(xiàn)象。這些結(jié)果都提示RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系表達(dá)功能性的HCN通道。

3.HCN通道調(diào)控RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系的興奮性在電流鉗模式下記錄RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系的靜息膜電位,發(fā)現(xiàn)ZD 7288(30μM)或Ivabradine(30μM)都能使膜電位發(fā)生一定程度的超極化,表明HCN通道在RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系的靜息狀態(tài)會(huì)激活,這些激活的HCN通道使得細(xì)胞的膜電位發(fā)生了去極化,提高細(xì)胞興奮性。隨后我們發(fā)現(xiàn)RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系在超極化刺激結(jié)束時(shí)形成反跳去極化,部分細(xì)胞反跳去極化會(huì)伴隨動(dòng)作電位。反跳去極化是細(xì)胞對(duì)超極化刺激的一種反饋補(bǔ)償機(jī)制,也是細(xì)胞興奮性的一種特征。當(dāng)我們給HCN通道的阻斷劑ZD 7288或者Ivabradine時(shí)均使得,發(fā)現(xiàn)反跳去極化會(huì)有明顯的一個(gè)延遲發(fā)放,主要體現(xiàn)在反跳去極化的潛伏期加長(zhǎng),幅度減弱,。而部分發(fā)放動(dòng)作電位的反跳去極化基礎(chǔ)上的在給HCN通道的阻斷劑后動(dòng)作電位也會(huì)消失,。事實(shí)上HCN通道的阻斷劑本身并不影響鈉通道,這些結(jié)果進(jìn)一步提示HCN通道參與RIN-14B大鼠胰島素瘤細(xì)胞系興奮性的調(diào)控。

參考文獻(xiàn)

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