背景^[1-3]

RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系是一種來源于大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞的細胞系，常用于研究視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生機制、藥物篩選和毒性評價等。該細胞系具有以下特點：

來源：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系來源于大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞，經(jīng)過多次傳代和篩選，形成了一個相對穩(wěn)定的細胞系。

形態(tài)特征：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系呈多邊形或長條形，大小約為15-30微米，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁明顯。

生長特性：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系生長迅速，傳代周期約為24-48小時，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。

特異性標志物：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系表達多種特異性標志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鑒定其視網(wǎng)膜Müller細胞特性。

其他特性：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系還具有一定的增殖能力，可用作研究視網(wǎng)膜疾病發(fā)生機制和藥物篩選的模型。

RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系

RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系培養(yǎng)操作

1)復蘇RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系可以用于非諾貝特對年齡相關(guān)性黃斑變性晚期視網(wǎng)膜纖維化的抑制作用及機制研究

檢測非諾貝特對AMD晚期視網(wǎng)膜纖維化的影響,并探討其作用的分子機制。

方法:新生血管性AMD模型采用極低密度脂蛋白受體(Vldlr)敲除小鼠,細胞模型選擇RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系。Vldlr-/-小鼠從2月齡開始分別喂食正常飼料或含非諾貝特飼料45天。RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系使用TGF-β2處理后分為溶劑組或非諾貝特酸組。用免疫印跡法和免疫熒光染色檢測纖維化標記蛋白的表達來評估視網(wǎng)膜纖維化程度,包括波形蛋白,膠原蛋白,α-SMA和纖連蛋白。Masson染色檢測膠原沉積。免疫印跡法檢測TGF/Smad信號和Wnt信號激活情況。采用qRT-PCR、Western blot、免疫組化等方法檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達。

結(jié)果:正常飼料組Vldlr-/-小鼠視杯中纖維化標志物Collagen-1、α-SMA和Vimentin表達增加,而這些纖維化標志物在非諾貝特飼料組的小鼠視杯中的表達明顯減少。在正常飼料組小鼠視杯中纖維化相關(guān)信號通路TGFβ/Smad信號通路和Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白p-Smad2/3和n-p-β-catenin表達明顯升高,而這種升高在非諾貝特飼料組中被抑制。同時,這兩條信號通路的下游基因CTGF的表達在正常飼料組中明顯升高,而非諾貝特飼料組中相對減少。TGFβ2處理可以使RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細胞系中TGFβ/Smad信號通路和Wnt信號通路激活,這兩種信號通路的激活可以被非諾貝特酸抑制。同時,TGFβ2可以使Muller細胞GFAP和CTGF表達增加,使用非諾貝特酸處理后GFAP和CTGF的表達被抑制。結(jié)論:非諾貝特抑制視網(wǎng)膜纖維化通過抑制TGFβ/Smad信號和Wnt信號和減少CTGF在新生血管性AMD的釋放。非諾貝特可能是一種潛在的治療AMD纖維化的藥物。

參考文獻

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