背景^[1-3]

LX-2人肝星形細(xì)胞是一種常用的細(xì)胞系，用于研究肝星形細(xì)胞的生物學(xué)特性和肝纖維化等方面的機(jī)制。這種細(xì)胞系是通過(guò)將SV40大T抗原轉(zhuǎn)染永生化原代人肝星狀細(xì)胞，然后在低血清培養(yǎng)基條件下選擇性培養(yǎng)早期傳代細(xì)胞而產(chǎn)生的。

LX-2人肝星形細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣的形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，可以用于體外實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬肝纖維化的過(guò)程或研究肝星形細(xì)胞的生物學(xué)特性。此外，這種細(xì)胞系還可以用于藥物篩選和毒性測(cè)試等方面。

LX-2人肝星形細(xì)胞系是一種永生化的細(xì)胞系，可以連續(xù)傳代，但在傳代過(guò)程中需要注意避免污染和交叉污染。同時(shí)，為了保持細(xì)胞的穩(wěn)定性和生物學(xué)特性，需要使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

LX-2人肝星形細(xì)胞是一種重要的細(xì)胞系，在肝纖維化和藥物篩選等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

LX-2人肝星形細(xì)胞

LX-2人肝星形細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇LX-2人肝星形細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)LX-2人肝星形細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)LX-2人肝星形細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

LX-2人肝星形細(xì)胞系可以用于RHL抑制大鼠肝纖維化及LX-2人肝星形細(xì)胞系增殖的機(jī)制

通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討賴(lài)氨大黃酸(RHL)抗大鼠膽汁淤積性肝纖維化的具體分子機(jī)制。于此同時(shí),體外培養(yǎng)人肝星形細(xì)胞(HSC)中的LX-2人肝星形細(xì)胞系株,探討RHL抑制HSC活化、增殖的具體作用機(jī)制。為RHL治療膽汁淤積性肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法1)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、賴(lài)氨酸組、35 mg·kg-1及70 mg·kg-1RHL組,每組6只,膽總管結(jié)扎(BDL)手術(shù)制備膽汁淤積性肝纖維化動(dòng)物模型。

(2) 進(jìn)行HE染色,鏡下觀(guān)察各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變;Masson染色觀(guān)察各組大鼠肝臟組織纖維化程度。

(3) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中Smad2、Smad3 m RNA的相對(duì)表達(dá)量。

(4) 采用Western blotting方法,檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中Smad2、Smad3的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2) 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)體外培養(yǎng)HSC中的LX-2人肝星形細(xì)胞系株,分成四個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別為對(duì)照組、RHL三個(gè)劑量組(50、100和150μmol·l-1)。

(2) 用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組LX-2人肝星形細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期情況。

(3) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Smad2和Smad3在各實(shí)驗(yàn)組LX-2人肝星形細(xì)胞系中的表達(dá)情況。

(4) 應(yīng)用q RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)中Smad2、Smad3 m RNA的相對(duì)表達(dá)。

(5) 采用Western blotting方法,檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組LX-2人肝星形細(xì)胞系中Smad2、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié)果1)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)病理學(xué)檢查結(jié)果可見(jiàn),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)大量被破壞,匯管區(qū)顯著增生并伴纖維大量增生;與模型組比較,RHL組大鼠肝臟組織中的肝臟小葉結(jié)構(gòu)較為完整,結(jié)構(gòu)損傷輕微,膽管周?chē)p度增生,纖維堆積較少且不明顯。動(dòng)物模型建立成功。

(2) q RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肝臟組織中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,RHL組大鼠肝臟組織中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3) 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RHL組LX-2人肝星形細(xì)胞系GO/1期細(xì)胞比例明顯升高,S期細(xì)胞比例明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(3) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Smad2和Smad3在LX-2人肝星形細(xì)胞系胞漿中表達(dá),與對(duì)照組相比,RHL組細(xì)胞的表達(dá)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(4) q RT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,RHL組處理過(guò)得LX-2人肝星形細(xì)胞系中Smad2、Smad3 m RNA和蛋白表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論1)RHL可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo),達(dá)到抗纖維化的作用。2)RHL可能是通過(guò)促進(jìn)LX-2人肝星形細(xì)胞系的凋亡,達(dá)到抑制LX-2人肝星形細(xì)胞系增殖的作用。3)RHL可能是通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),達(dá)到抑制HSC細(xì)胞活化的作用。

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