背景^[1-3]

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系是一種常用的實(shí)驗(yàn)動物模型，用于研究黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療。該細(xì)胞系來源于C57BL/6小鼠，具有高度的惡性程度和侵襲性，能夠快速生長并形成腫瘤。

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系的主要特點(diǎn)是：

高度惡性：S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系具有高度的惡性程度，能夠在體外快速生長并形成腫瘤。

侵襲性：S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的侵襲性，能夠穿過基底膜并進(jìn)入周圍組織。

易轉(zhuǎn)移：S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以通過血液或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到其他部位。

可重復(fù)性好：S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系的生長和轉(zhuǎn)移過程可以重復(fù)多次，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究中，包括腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究、抗腫瘤藥物的篩選和評價、腫瘤免疫治療的研究等。

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系可以用于細(xì)胞松弛素Q靶向肌酸激酶B抗黑色素瘤的作用及機(jī)制研究

探究真菌Xylaria sp.DO1801次級代謝產(chǎn)物CQ的抗黑色素瘤作用,并解析其對細(xì)胞骨架微絲聚合的影響及分子機(jī)制。首先,本研究通過構(gòu)建體內(nèi)B16同種異體小鼠皮下瘤模型,結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)檢測CQ對黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及微絲解聚作用的影響,研究CQ抗黑色素瘤的藥理作用。

研究發(fā)現(xiàn),CQ通過誘導(dǎo)微絲解聚導(dǎo)致S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系增殖抑制、凋亡增加、遷移受限,從而發(fā)揮良好的抗黑色素瘤效應(yīng)。隨后,通過LC-MC非靶向代謝組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地分析CQ對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)小分子代謝物的影響,進(jìn)一步探究CQ對黑色素瘤細(xì)胞代謝過程的影響并解析其作用分子機(jī)制。S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),CQ主要影響黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)肌酸代謝通路,而磷酸肌酸預(yù)處理可拮抗CQ的作用,恢復(fù)胞內(nèi)ATP水平、抑制微絲解聚、減少增殖抑制并抵抗凋亡誘導(dǎo)。此外,檢測黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝發(fā)現(xiàn)CQ抑制S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系內(nèi)葡萄糖攝取、糖酵解和氧化磷酸化,表明CQ可抑制黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)肌酸代謝和葡萄糖代謝,從而抑制相關(guān)的ATP再生并誘使細(xì)胞骨架微絲解聚。

最后,基于肌酸激酶B(CKB)在腫瘤細(xì)胞肌酸代謝中的核心作用,通過細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析實(shí)驗(yàn)(CETSA)、微量熱泳動(MST)實(shí)驗(yàn)、體外酶活抑制實(shí)驗(yàn)和分子對接的方法研究CQ對CKB的作用方式,明確CQ的作用靶點(diǎn)和相關(guān)分子機(jī)制。S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),CQ以底物競爭的方式抑制CKB酶活性。CKB低表達(dá)的S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系內(nèi)ATP濃度降低、微絲聚合抑制、細(xì)胞增殖減少、凋亡增加,但對CQ敏感性降低。檢測腫瘤相關(guān)代謝通路和肌酸代謝關(guān)鍵酶胍基乙酸-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GAMT)和CKB發(fā)現(xiàn),CQ處理或CKB沉默后,S91小鼠黑色素瘤細(xì)胞系內(nèi)PI3K/AKT/FoxO1信號通路下調(diào),然而肌酸和磷酸肌酸可逆轉(zhuǎn)CQ對PI3K/AKT/FoxO1信號通路的下調(diào);同時,CQ處理或CKB沉默抑制GAMT和CKB表達(dá),而肌酸、磷酸肌酸、激活PI3K通路可恢復(fù)GAMT和CKB的表達(dá)。這提示肌酸代謝與PI3K/AKT/FoxO1通路間可形成反饋環(huán)并介導(dǎo)CQ促微絲解聚和抗黑色素瘤作用。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CQ通過靶向抑制CKB,干擾肌酸代謝,并以反饋環(huán)的形式下調(diào)PI3K/AKT/FoxO1通路,從而促進(jìn)微絲解聚并介導(dǎo)其級聯(lián)的抗黑色素瘤作用。

參考文獻(xiàn)

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