背景及概述^[1,2]

磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預(yù)防和治療感染性疾病，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)因其性質(zhì)穩(wěn)定，制造不需糧食做原料產(chǎn)量大品種多價(jià)格低使用簡便供應(yīng)充足等優(yōu)點(diǎn)，在獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑或動(dòng)物疾病治療藥物廣泛應(yīng)用長期使用極易在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，致使抗生素殘留這類藥物顯著的毒副作用也引起了人們的廣泛關(guān)注。例如：影響泌尿系統(tǒng)功能，引起結(jié)晶尿血尿等反應(yīng)及致癌性磺胺類藥物吸收后分布于全身各組織中，以血肝腎含量最高且與血漿蛋白結(jié)合率高，所以在體內(nèi)維持時(shí)間長還能透入腦膜積液和其他積液，以及通過胎盤進(jìn)入胎循環(huán)，對(duì)孕婦及嬰兒極其不利，還易在尿中析出結(jié)晶，導(dǎo)致結(jié)石而損害腎臟因此歐盟和美國等大多數(shù)國家規(guī)定食品和飼料中磺胺類藥物總量不得超過0.1mg/kg。

藥理作用^[1]

磺胺二甲基嘧啶(SM2)是小分子藥物，屬于典型的半抗原，它本身不能誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生抗體，必須將其與蛋白質(zhì)等大分子載體偶聯(lián)，形成人工合成的完全抗原，進(jìn)而制備相應(yīng)的抗體這也是建立免疫分析過程的前提和關(guān)鍵所在本實(shí)驗(yàn)分別采用重氮化(直接連接)戊二醛法(引入間隔臂)將SMT偶聯(lián)到牛血清白蛋白(BSA)上，用合成的完全抗原免疫小鼠，免疫周期結(jié)束后眼眶取血，用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血清效價(jià)，比較兩種不同方法合成的完全抗原的免疫效果為下一步的SM2單克隆抗體的制備和SM2殘留檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

合成路線^[3]

磺胺二甲基嘧啶(SM2) (sulfamearizne)是常用磺胺類藥物之一,它的合成方法很多,最常用的也是我國工業(yè)上所采用的方法,是以磺胺瞇與丁酮縮酸以甲醇鈉為縮合劑而制得:

丁酮縮醛是以丙酮,甲酸甲醋為原料,以金屬鈉為縮合劑,在二甲苯中首先制得甲酸丙酮鈉,再與甲醇在氯磺酸存在下脫水而得縮醛。

水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的測(cè)定^[4]

磺胺二甲基嘧啶是畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的磺胺類藥物,廣泛用于畜禽疾病的治療和預(yù)防. 但過量食用含磺胺二甲基嘧啶的動(dòng)物組織能導(dǎo)致人的機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng),破壞機(jī)體正常菌群生態(tài)平衡,導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性. 因此歐美和日本都對(duì)動(dòng)物食品中的磺胺類藥物總量作了規(guī)定。

1.樣品前處理方法  磺胺二甲基嘧啶不溶于水,易溶于稀酸和乙酸乙酯,不溶于正己烷.關(guān)于肌肉組織中磺胺二甲嘧啶的提取方法,已有的報(bào)道大多用二氯甲烷、乙酸乙酯或偏磷酸一甲醇(體積分?jǐn)?shù)為2∶1)作提取溶劑.用二氯甲烷提取時(shí),組織漂浮在提取溶劑表面,傾倒困難;使用偏磷酸一甲醇作提取溶劑時(shí),由于溶液含有大量的水分,造成減壓蒸餾耗時(shí)費(fèi)力;使用乙酸乙酯提取效率最高,但提取的組織內(nèi)源性物質(zhì)也最多,凈化較困難,凈化方法還需要進(jìn)一步研究.采用乙腈作提取溶劑,提取效率較低,但增加提取溶劑的量,可獲得滿意的回收率,另外用乙腈提取時(shí)共提的雜質(zhì)也較少.經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn),用25mL乙腈,提取2次,可將目標(biāo)分析物提取出來. 鹽析會(huì)促進(jìn)溶質(zhì)的析出,可提高有機(jī)溶劑提取效果.本試驗(yàn)在提取溶劑中加入無水硫酸鈉,除了能夠吸收樣品中的水分,起到除水的作用,還能提高磺胺二甲基嘧啶提取效率.當(dāng)無水硫酸鈉添加至4.0g時(shí),回收率不再增加.因此,選用添加無水硫酸鈉的量為4.0g. 正己烷的作用主要是起到去除乙腈提取磺胺二甲基嘧啶時(shí)含有的脂肪等油類雜質(zhì).

2.流動(dòng)相的選擇  分別用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-冰乙酸3種流動(dòng)相對(duì)陰性生物樣品和磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以乙腈-水-冰乙酸做流動(dòng)相.對(duì)乙腈、水、冰乙酸的配比做了進(jìn)一步考察表明,當(dāng)流動(dòng)相乙腈、水、冰乙酸的體積比為20∶80∶0.5時(shí),磺胺二甲基嘧啶峰形對(duì)稱,靈敏度高,重現(xiàn)性好,且與生物的本底有良好分離,無干擾.

3.線性關(guān)系、檢測(cè)限和回收率  用流動(dòng)相配制0.02～0.2μg/mL磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,以磺胺二甲基嘧啶的峰面積y為縱坐標(biāo),磺胺二甲基嘧啶的質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析(回歸方程為y=118.4088x-0.1190,相關(guān)系數(shù)為0.9981).分別在鯽魚、鰻魚、羅非魚、南美白對(duì)蝦等樣品中以30μg/kg的水平添加磺胺二甲基嘧啶,按本文中的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和分析,得到的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表1所示.該方法的檢測(cè)限(S/N=3)為5μg/kg。

參考文獻(xiàn)

[1]   栗世婷．磺胺二甲基嘧啶完全抗原的合成和鑒定[J]．藥物生物技術(shù)，2017，24（04）：294-298．

[2]   張偉，鐘理，許若丹，等．磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗體制備[J]．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（06）：76-80．

[3]   陳啟槐，奚紹祁．磺胺甲基嘧啶合成新法[J]．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1966（01）：59-60．

[4]   張振霖．水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶殘留量的高效液相色譜法測(cè)定[J]．重慶工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，23（03）：76-78．