背景及概述^[1,2]

磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預防和治療感染性疾病，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)因其性質(zhì)穩(wěn)定，制造不需糧食做原料產(chǎn)量大品種多價格低使用簡便供應(yīng)充足等優(yōu)點，在獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物廣泛應(yīng)用長期使用極易在動物體內(nèi)蓄積，致使抗生素殘留這類藥物顯著的毒副作用也引起了人們的廣泛關(guān)注。例如：影響泌尿系統(tǒng)功能，引起結(jié)晶尿血尿等反應(yīng)及致癌性磺胺類藥物吸收后分布于全身各組織中，以血肝腎含量最高且與血漿蛋白結(jié)合率高，所以在體內(nèi)維持時間長還能透入腦膜積液和其他積液，以及通過胎盤進入胎循環(huán)，對孕婦及嬰兒極其不利，還易在尿中析出結(jié)晶，導致結(jié)石而損害腎臟因此歐盟和美國等大多數(shù)國家規(guī)定食品和飼料中磺胺類藥物總量不得超過0.1mg/kg。

藥理作用^[1]

磺胺二甲基嘧啶(SM2)是小分子藥物，屬于典型的半抗原，它本身不能誘導生物體產(chǎn)生抗體，必須將其與蛋白質(zhì)等大分子載體偶聯(lián)，形成人工合成的完全抗原，進而制備相應(yīng)的抗體這也是建立免疫分析過程的前提和關(guān)鍵所在本實驗分別采用重氮化(直接連接)戊二醛法(引入間隔臂)將SMT偶聯(lián)到牛血清白蛋白(BSA)上，用合成的完全抗原免疫小鼠，免疫周期結(jié)束后眼眶取血，用酶聯(lián)免疫分析法測定血清效價，比較兩種不同方法合成的完全抗原的免疫效果為下一步的SM2單克隆抗體的制備和SM2殘留檢測奠定了基礎(chǔ)。

合成路線^[3]

磺胺二甲基嘧啶(SM2) (sulfamearizne)是常用磺胺類藥物之一,它的合成方法很多,最常用的也是我國工業(yè)上所采用的方法,是以磺胺瞇與丁酮縮酸以甲醇鈉為縮合劑而制得:

丁酮縮醛是以丙酮,甲酸甲醋為原料,以金屬鈉為縮合劑,在二甲苯中首先制得甲酸丙酮鈉,再與甲醇在氯磺酸存在下脫水而得縮醛。

水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的測定^[4]

磺胺二甲基嘧啶是畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的磺胺類藥物,廣泛用于畜禽疾病的治療和預防. 但過量食用含磺胺二甲基嘧啶的動物組織能導致人的機體發(fā)生過敏反應(yīng),破壞機體正常菌群生態(tài)平衡,導致致病菌產(chǎn)生耐藥性. 因此歐美和日本都對動物食品中的磺胺類藥物總量作了規(guī)定。

1.樣品前處理方法  磺胺二甲基嘧啶不溶于水,易溶于稀酸和乙酸乙酯,不溶于正己烷.關(guān)于肌肉組織中磺胺二甲嘧啶的提取方法,已有的報道大多用二氯甲烷、乙酸乙酯或偏磷酸一甲醇(體積分數(shù)為2∶1)作提取溶劑.用二氯甲烷提取時,組織漂浮在提取溶劑表面,傾倒困難;使用偏磷酸一甲醇作提取溶劑時,由于溶液含有大量的水分,造成減壓蒸餾耗時費力;使用乙酸乙酯提取效率最高,但提取的組織內(nèi)源性物質(zhì)也最多,凈化較困難,凈化方法還需要進一步研究.采用乙腈作提取溶劑,提取效率較低,但增加提取溶劑的量,可獲得滿意的回收率,另外用乙腈提取時共提的雜質(zhì)也較少.經(jīng)過反復試驗,用25mL乙腈,提取2次,可將目標分析物提取出來. 鹽析會促進溶質(zhì)的析出,可提高有機溶劑提取效果.本試驗在提取溶劑中加入無水硫酸鈉,除了能夠吸收樣品中的水分,起到除水的作用,還能提高磺胺二甲基嘧啶提取效率.當無水硫酸鈉添加至4.0g時,回收率不再增加.因此,選用添加無水硫酸鈉的量為4.0g. 正己烷的作用主要是起到去除乙腈提取磺胺二甲基嘧啶時含有的脂肪等油類雜質(zhì).

2.流動相的選擇  分別用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水-冰乙酸3種流動相對陰性生物樣品和磺胺二甲基嘧啶標準溶液進行分離試驗發(fā)現(xiàn),以乙腈-水-冰乙酸做流動相.對乙腈、水、冰乙酸的配比做了進一步考察表明,當流動相乙腈、水、冰乙酸的體積比為20∶80∶0.5時,磺胺二甲基嘧啶峰形對稱,靈敏度高,重現(xiàn)性好,且與生物的本底有良好分離,無干擾.

3.線性關(guān)系、檢測限和回收率  用流動相配制0.02～0.2μg/mL磺胺二甲基嘧啶標準溶液進行分析,以磺胺二甲基嘧啶的峰面積y為縱坐標,磺胺二甲基嘧啶的質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標進行線性回歸分析(回歸方程為y=118.4088x-0.1190,相關(guān)系數(shù)為0.9981).分別在鯽魚、鰻魚、羅非魚、南美白對蝦等樣品中以30μg/kg的水平添加磺胺二甲基嘧啶,按本文中的方法對樣品進行處理和分析,得到的回收率和相對標準偏差(RSD)如表1所示.該方法的檢測限(S/N=3)為5μg/kg。

參考文獻

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[2]   張偉，鐘理，許若丹，等．磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗體制備[J]．河北農(nóng)業(yè)大學學報，2005（06）：76-80．

[3]   陳啟槐，奚紹祁．磺胺甲基嘧啶合成新法[J]．藥學學報，1966（01）：59-60．

[4]   張振霖．水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶殘留量的高效液相色譜法測定[J]．重慶工學院學報(自然科學版)，2009，23（03）：76-78．