背景[1-7]
人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知待測(cè)物質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將待測(cè)物質(zhì)和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。利用產(chǎn)生顏色以及顏色的深淺和樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度呈比例關(guān)系來(lái)檢測(cè)未知樣品的種類及濃度。
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7. 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
9.按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
試劑盒操作步驟:
1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。4.甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
4. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
5. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
6. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
7. 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9.在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
試劑盒試劑盒性能特點(diǎn)：
1.靈敏度：最小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
試劑盒結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的待測(cè)物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
應(yīng)用[8]
人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT可用于檢測(cè)人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫活性：
在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在細(xì)胞中表達(dá)實(shí)驗(yàn)中用PCR技術(shù)擴(kuò)增GPC3基因,利用酶切位點(diǎn)將該序列插入p3XFLAG-CMV-14載體,構(gòu)建p CMV-gpc3表達(dá)載體。通過(guò)脂質(zhì)體將該載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)最終結(jié)果。收集穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞,破碎,通過(guò)親和層析柱,獲得純度較高的GPC3蛋白。但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)前需要檢測(cè)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫活性及濃度才能保證后續(xù)免疫試驗(yàn)的成功。
參考文獻(xiàn)
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