背景及概述[1]
吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth，石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.Var.ibodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有上百年歷史，是一種傳統(tǒng)中藥。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效，常用于厥陽頭痛、寒病腹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉、高血壓等癥。吳茱萸堿是其主要生物堿成分，是色胺吲哚類生物堿，其分子式為C19H17N3O，分子量為303.36。黃色片狀晶體或結(jié)晶性粉末。熔點278℃，比旋光度[α]D20+352°(丙酮)。溶于丙酮，微溶于氯仿，不溶于水、苯及石油醚。遇濃硫酸或濃鹽酸顯橙紅色，放置轉(zhuǎn)為紅棕色，加水稀釋轉(zhuǎn)為藍色，堿化后產(chǎn)生污色沉淀。從吳茱萸果實中提取分離而得。有升高血壓作用。。
藥理作用及應(yīng)用[2]
1. 抗腫瘤作用
1）抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡壞死吳茱萸堿能誘導(dǎo)人肝癌HepG2、黑色素瘤A375-S2、宮頸癌HeLa等多種腫瘤細胞凋亡。用64、16、4、1、0.25μmol·L-1濃度的吳茱萸堿處理HepG2細胞72h的抑制率分別為74.0%、69.0%、60.5%、44.0%、16.4%。DAPI染色后吳茱萸堿組癌細胞均表現(xiàn)出較為典型的細胞凋亡特征。流式細胞儀檢測1μmol·L-1吳茱萸堿作用24h和36h出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，細胞周期阻滯于G2/M期。吳茱萸堿能引起A375-S2細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB易位，用泛素-蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理后，吳茱萸堿在24h引起更多的A375-S2細胞死亡。MG132能減少胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）磷酸化，激活caspase-3，增加Fas-L表達，下調(diào)Bcl-2的表達，提示吳茱萸堿對A375-S2細胞誘導(dǎo)凋亡的作于與caspase有關(guān)，并能通過泛素-蛋白酶體途徑增強。吳茱萸堿能劑量依賴性降低未分化甲
狀腺癌（ARO）細胞增值率，將癌細胞阻滯在G2/M期伴隨cdc25c、cyclinB1、cdc2-p161蛋白表達增加，在48h至72h能觀察到細胞凋亡，caspase-8、caspase-9和caspase-3被激活，提示吳茱萸堿抑制ARO細胞增殖和caspase通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能夠抑制體外結(jié)腸癌lovo細胞的增殖，60mmol·L-1時能阻滯細胞停留在S期并引起細胞凋亡，caspase-8、caspase-9和caspase-3被激活，進一步在結(jié)腸癌移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿增加Tunel陽性細胞數(shù)，這些結(jié)果表明吳茱萸堿通過caspase凋亡通路和阻滯癌細胞停留在S期在離體和在體兩方面抑制人結(jié)腸癌細胞增殖。
2）抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移
研究中發(fā)現(xiàn)當腫瘤細胞在含有吳茱萸堿的纖維素結(jié)合板上培養(yǎng)時，其擴散受到明顯抑制。用10mg/ml處理的小鼠結(jié)腸癌細胞26-L5移植到小鼠體內(nèi)后，肺轉(zhuǎn)移抑制率達到70%。而在26-L5細胞荷瘤鼠接種后第六天給予10mg/kg吳茱萸堿，肺轉(zhuǎn)移抑制率達48%，與順鉑產(chǎn)生的抑制作用相當。相對于順鉑會嚴重減少小鼠體重，吳茱萸堿并不對實驗期間小鼠體重產(chǎn)生影響。因此，吳茱萸堿有望作為一種有效化合物用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移。
2. 對心血管系統(tǒng)作用
吳茱萸堿（0.03μmol·L-1～1μmol·L-1）劑量依賴性增強豚鼠離體心房收縮力，加快收縮頻率，達到1μmol·L-1時能引起收縮。競爭性辣椒素受體（VR1）拮抗劑Capsazepine(10μmol·L-1)、非競爭性VR1拮抗劑釕紅（10μmol·L-1）和選擇性降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）受體拮抗劑CGRP8-37（10μmol·L-1）能取消這種作用，提示吳茱萸堿對豚鼠離體心房的興奮作用與激活VR1促進CGRP釋放有關(guān)。吳茱萸堿能防止心臟過敏性損傷。用特異性抗原牛血清白蛋白預(yù)先致敏的豚鼠心臟冠脈流量減少，左心室壓明顯降低，心率加快，P-R期延長。使用吳茱萸堿（0.3μmol·L-1或1μmol·L-1）能夠顯著增加冠脈流出液中CGRP的含量，改善心臟功能，縮短P-R期。1μmol·L-1吳茱萸堿還能抑制竇性心動過速。吳茱萸堿對心臟過敏反應(yīng)的保護作用可被CGRP8-37取消，提示吳茱萸堿對心臟過敏損傷的保護作用與CGRP的釋放有關(guān)。
3. 減肥、降血糖作用
吳茱萸堿干預(yù)大鼠13周后，降低肥胖大鼠體重和Lee's指數(shù)，降低肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪重量和內(nèi)臟脂肪重量指數(shù)，并降低肥胖大鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量。吳茱萸堿能逆轉(zhuǎn)肥胖并發(fā)的血管肥厚；與正常大鼠相比，肥胖大鼠胸主動脈組織和DRG中瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道（TRPV1）表達降低，血清和腹主動脈CGRP增加。吳茱萸堿和辣椒素能增加胸主動脈組織和DRG中TRPV1的表達；吳茱萸堿能降低血清和腹主動脈中CGRP含量，其作用機制可能與調(diào)節(jié)血清、血管組織和DRG中CGRP和TRPV1的表達有關(guān)。4mmol·L-1的吳茱萸堿能抑制人類白前脂肪細胞（HWP）的分化，并下調(diào)基因啟動子保守序列（GATA）結(jié)合蛋白2和3（GATA2，GATA3）mRNA和蛋白的表達，提示吳茱萸堿可能具有較好預(yù)防肥胖的作用。體外實驗中，吳茱萸堿能抑制3T3-L1和C3H10T1/2等脂肪細胞的分化，尤其是在早期誘導(dǎo)階段。給db/db小鼠連續(xù)14天腹腔注射吳茱萸堿，小鼠體重明顯減少，附睪白色脂肪組織與體重比值顯著降低。血糖水平降低程度與羅格列酮相當，血漿胰島素降低水平比羅格列酮更顯著，吳茱萸堿還能改善脂肪和糖原沉積引起的肝損害。
4. 抗炎鎮(zhèn)痛作用
研究吳茱萸堿是否能抑制低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能夠劑量依賴性的抑制環(huán)氧化物酶（COX-2）和一氧化氮合酶（iNOS）表達，減少前列腺素（E2）釋放。阻斷低氧誘發(fā)的AKt、70kDa核糖體蛋白S6激酶（p70S6K）和4E結(jié)合蛋白（4E-BP）磷酸化，調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)性因子（HIF-1alpha）翻譯過程，對mRNA水平和蛋白降解率沒有影響。提示吳茱萸堿主要通過介導(dǎo)Akt和p70S6K的去磷酸化而抑制低氧誘導(dǎo)的COX-2表達。吳茱萸堿顯著抑制醋酸引起的扭體次數(shù)，給予吳茱萸堿的小鼠離體回腸喪失了對感覺神經(jīng)刺激的反應(yīng)，保留了對迷走神經(jīng)刺激的反應(yīng)，吳茱萸堿通過感覺神經(jīng)脫敏而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
5. 內(nèi)分泌系統(tǒng)
吳茱萸堿可以通過降低細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）相關(guān)途徑的活性，抑制3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）等類固醇激素生成相關(guān)酵素的活性，降低并影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與RNA活化蛋白（StAR）表達，直接作用于大鼠腎上腺皮質(zhì)束網(wǎng)帶細胞抑制皮質(zhì)酮分泌。10-4mol·L-1吳茱萸堿孵育大鼠睪丸間質(zhì)細胞（TICs）1、2、4h有效降低睪酮的基本水平以及人體絨毛膜促性腺激素刺激的睪酮分泌，抑制弗司扣林引起的睪酮釋放。吳茱萸堿還可抑制8-Br-cAMP和雄甾烯二酮引起的睪酮釋放。
6. 對阿爾茨海默癥作用
利用Morris水迷宮實驗檢測吳茱萸堿對阿爾茨海默癥小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，正電子發(fā)射斷層成像術(shù)/計算機斷層成像術(shù)（PET/CT）檢測腦組織糖攝取，酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平，蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）測定COX-2蛋白表達水平，結(jié)果在SAMP8和APP(swe)/PS1 (ΔE9)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)100mg·kg-1·d-1吳茱萸堿顯著改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默癥引起的糖攝取抑制，降低IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）、COX-2等與阿爾茨海默癥引起的炎癥相關(guān)的因子。提示吳茱萸堿能改善阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠的認知能力。
7. 免疫抑制
吳茱萸堿通過Bcl-2、CDK2上調(diào)，抑制8周齡雄性C57BL/6小鼠體外培養(yǎng)的脾和胸腺淋巴細胞增殖誘導(dǎo)其凋亡，細胞分泌L-2和L-12的生物活性也明顯下降，細胞內(nèi)ROS水平增高，但隨著藥物處理時間的延長，細胞死亡率升高，死亡細胞內(nèi)ROS水平明顯降低。分離BALB/c小鼠骨髓細胞，經(jīng)GM-CSF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)10天的未成熟DC細胞（iDC），利用SuperArray公司小鼠DC與抗原提呈細胞基因芯片MM-604對細胞功能相關(guān)基因進行檢測，結(jié)果表明吳茱萸堿對DC作用涉及多個基因的表達調(diào)控，這些基因調(diào)控并影響著DC功能、分化和成熟。進一步利用抗體芯片技術(shù)和ELISA檢測吳茱萸堿對DC分泌相關(guān)細胞因子的影響，結(jié)果顯示吳茱萸堿促進了iDC和成熟DC（mDC）抗原提呈功能，對iDC、mDC的細胞因子IL-10、IL-12分泌功能無影響，吳茱萸堿處理iDC后上調(diào)大于2倍的細胞因子有7個，處理mDC后上調(diào)大于2倍的細胞因子有2個，這些細胞因子影響著DC的抗原攝取、遷移、抗原提呈，為進一步尋找藥物靶點提供了線索。
制備[3]
吳茱萸中分離吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法，具體制備方法包括以下步驟：
(1)取原料適量，加入1-50倍量的溶劑，所述溶劑為：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯，或其混合溶劑，混合溶劑體積比控制為1：9～9：1，或甲醇、乙醇、丙酮水溶液，控制體積比為50％～95％，提取1-5次，每次1-4h，合并提取液回收溶劑得到浸膏；
(2)將步驟(1)中得到的浸膏用1-100倍量的低極性溶劑脫脂1-5次，然后再用1-100倍浸膏量的1-10％的鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸水溶液浸泡洗滌1-48h，如此操作反復(fù)進行1-6次；
(3)將步驟(2)中得到的洗滌后的固體加入到1-100倍量的1-20％的氨水、氫氧化鈣、氫氧化鈉或氫氧化鉀水溶液中，充分溶解1-48h，過濾，取出殘余固體，再加鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸水溶液反應(yīng)1-48h，過濾或離心，得到固體；
(4)將步驟(3)中得到的固體用1-200倍量二氯甲烷、氯仿、丙酮或乙酸乙酯溶解，再過濾或離心，得到固液兩相，取出固液相分別用1-100倍量1-30％的氨水、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、磷酸一氫鈉、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的水溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)1-48h，液相部分經(jīng)反應(yīng)后，析出固體，過濾或離心，洗滌，干燥，得到吳茱萸堿粗品，固相部分經(jīng)反應(yīng)后，過濾或離心，洗滌，干燥，得到吳茱萸次堿粗品；
(5)將上述吳茱萸堿粗品和吳茱萸次堿粗品，用二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、異丙醇或它們的混合溶劑進行結(jié)晶和重結(jié)晶，最終得到高純度的吳茱萸堿和吳茱萸次堿晶體。
主要參考資料
[1] 化學(xué)物質(zhì)辭典
[2] 吳茱萸堿的藥理學(xué)研究進展
[3] CN201810317452.0從吳茱萸中分離吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法