背景^[1-7]

人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA KIT是一款利用雙抗原夾心法檢測(cè)人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的酶聯(lián)免疫試劑盒。雙抗體夾心法，是將含有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗滌一次；加待測(cè)抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多余抗體洗除；加入與待測(cè)抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使形成“夾心”；加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，說明在孔壁上存在相應(yīng)的抗原。

實(shí)驗(yàn)原理：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標(biāo)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗該指標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

操作步驟：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。

人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA KIT優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度：人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA試劑盒有二層含義，1)為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2)為試劑對(duì)大量樣品中陽性檢出的能力。

特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測(cè)物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測(cè)定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。

精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時(shí)考察線性范圍。

準(zhǔn)確度：通過添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

簡(jiǎn)便性：人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA試劑盒指在不影響試劑的前三項(xiàng)指標(biāo)的前題下，實(shí)驗(yàn)和測(cè)定步驟越少越好，在定性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果判斷簡(jiǎn)單明了，定量試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算也應(yīng)簡(jiǎn)單。

安全性：指試劑對(duì)操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。

經(jīng)濟(jì)性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進(jìn)步降低成本，而市場(chǎng)價(jià)格比較合理。

操作時(shí)注意事項(xiàng)：

1.不同廠家生產(chǎn)的試劑盒因生產(chǎn)工藝和操作方法略有不同，務(wù)必按照所用試劑盒嚴(yán)格操作，否則容易產(chǎn)生檢測(cè)結(jié)果的不確定性。

2.若不同批號(hào)人ELISA試劑盒的不同組分(A液或酶工作液)，或不同試劑的不同組分進(jìn)行交叉使用，有可能出現(xiàn)顯色淺或本底高，花板等情形。

3.反應(yīng)時(shí)間的誤差，做大量標(biāo)本時(shí)，*孔和zui后一孔以及一些特殊標(biāo)本可能影響較大。

4.臨界值附近標(biāo)本波動(dòng)為正?，F(xiàn)象，任何試劑均不可避免。可以考慮將標(biāo)本做奇數(shù)次復(fù)檢。

5.加樣時(shí)樣品量誤差，對(duì)于陰或很陽的標(biāo)本影響不大，但對(duì)閾值附近的標(biāo)本影響極大，建議校對(duì)加樣器。

應(yīng)用^[8]

人絲裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)ELISA 試劑盒可用于人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：

例如在腫瘤壞死因子α通過絲裂原活化蛋白激酶激酶6誘導(dǎo)LA795肺腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中建立TNFα誘導(dǎo)LA795肺腺癌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞模型;使用人胚腎2 93包裝細(xì)胞制備絲裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen activatedproteinkinasekinase 6,MKK6)及其結(jié)構(gòu)活性和無活性突變體的重組腺病毒;使用人絲裂原活化蛋白激酶激酶6的ELISA法測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MKK6的激酶活性及表達(dá)水平。

參考文獻(xiàn)

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[3]Role of p38 protein kinase in heatinduced raw cells apoptosis.Zhang L,Zhang L,Jiang Y,et al.Chinese Medical Journal.2000

[4]Mitogen-activated protein kinase:conservation of a three-kinase module from yeast to human.Widmann C,Gibson S,Jarpe MB,et al.Physiological Reviews.1999

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[6]Inhibition of extracellular signalregulated kinase enhances ischemia/reoxygenation-induced apoptosis in cultured cardiac myocytes and exaggerates reperfusion injury in isolated perfused heart.Yue TL,Wang C,Gu JL,et al.Circulation Research.2000

[7]Apoptosis signaling pathway in T cells is composed of ICE/Ced-3 family protease and MAP kinase 6b.Huang S,Jiang Y,Li Z,et al.Immunity.1997

[8]劉愛華,鄧鵬,姜勇.腫瘤壞死因子α通過絲裂原活化蛋白激酶激酶6誘導(dǎo)LA795肺腺癌細(xì)胞凋亡[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003(02):27-31.