背景[1-8]
GST pulldown試劑盒是利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。
GST-pulldown主要包括以下三個(gè)部分：①利用基因重組技術(shù)構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體；②通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白；③利用GST親和純化柱進(jìn)行蛋白純化獲得高純度的融合蛋白，再利用GST親和純化柱進(jìn)行蛋白間的相互作用檢測(cè)。
基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。
實(shí)驗(yàn)注意內(nèi)源性蛋白的干擾使得實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的假陽性結(jié)果較多：
1. 高純度的GST融合蛋白能夠減少實(shí)驗(yàn)的假陽性。由于高純度的融合蛋白能減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，因此獲得高純度的融合蛋白對(duì)于GST-pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析具有重要的作用。同時(shí)，為了能夠程度的保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性，一般在獲取融合蛋白時(shí)傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關(guān)鍵。對(duì)于可溶性蛋白的獲得條件主要有①載體的選擇。②可溶性蛋白表達(dá)條件的選擇，③誘導(dǎo)溫度，④誘導(dǎo)時(shí)間，⑤誘導(dǎo)物的濃度，能夠不被細(xì)胞代謝而且具有穩(wěn)定的濃度。
2. GST標(biāo)簽雖然不會(huì)對(duì)下游蛋白的折疊和功能造成影響，促進(jìn)重組蛋白的可溶性表達(dá)，但是GST標(biāo)簽可能會(huì)影響蛋白的正確折疊，因此對(duì)融合蛋白進(jìn)行質(zhì)量控制，會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。
3. 在實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)會(huì)加入核酸酶來消除可能橋接到蛋白上的DNA和RNA，也有可能會(huì)導(dǎo)致蛋白間的相互作用。
應(yīng)用[9][10]
GST pulldown試劑盒可用于驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白：
例如在青島文昌魚（Branchiostoma belcheri tsingtaunese）GST和FREP基因的表達(dá)與功能研究中青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)腸cDNA文庫中,分離了具有完整編碼框的,與脊椎動(dòng)物肝臟功能密切相關(guān)的谷胱苷肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)和纖維蛋白原相關(guān)蛋白(FREP)基因,并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。
參考文獻(xiàn)
[1]Pathogen Recognition and Innate Immunity[J].Shizuo Akira,Satoshi Uematsu,Osamu Takeuchi.Cell.2006(4)
[2]Presence and localization of antithrombin and its regulation after acute lipopolysaccharide exposure in amphioxus,with implications for the origin of vertebrate liver[J].Yujun Liang,Shicui Zhang,Limin Lun,Li Han.Cell and Tissue Research.2006(3)
[3]Infectious non-self recognition in invertebrates:lessons from Drosophila and other insect models[J].Julien Royet.Molecular Immunology.2004(11)
[4]The chordate amphioxus:an emerging model organism for developmental biology[J].L.Z.Holland,V.Laudet,M.Schubert.Cellular and Molecular Life Sciences.2004(18)
[5]Cloning and phylogenetic analysis of an amphioxus myogenic bHLH gene AmphiMDF[J].Jinduo Yuan,Shicui Zhang,Zhenhui Liu,Zhidong Luan,Gengxi Hu.Biochemical and Biophysical Research Communications.2003(4)
[6]Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma[J].X.-Q.Yu,Y.-F.Zhu,C.Ma,J.A.Fabrick,M.R.Kanost.Insect Biochemistry and Molecular Biology.2002(10)
[7]The Role of Ficolins in Innate Immunity[J].Misao Matsushita,Teizo Fujita.Immunobiology.2002(4)
[8]Ascidian and Amphioxus Adh Genes Correlate Functional and Molecular Features of the ADH Family Expansion During Vertebrate Evolution[J].Cristian Ca?estro,Ricard Albalat,Lars Hjelmqvist,Laura Godoy,Hans J?rnvall,Roser Gonzàlez-Duarte.Journal of Molecular Evolution.2002(1)
[9]Bioinformatic tools for DNA/protein sequence analysis,functional assignment of genes and protein classification[J].B.Rehm.Applied Microbiology and Biotechnology.2001(5-6)
[10]Parasite-responsive IgSF members in the snail Biomphalaria glabrata:characterization of novel genes with tandemly arranged IgSF domains and a fibrinogen domain[J].Si-Ming Zhang,Pascale M.Léonard,Coen M.Adema,Eric S.Loker.Immunogenetics.2001(8)