背景[1-7]
熒光原位雜交(FISH)試劑盒原理是將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。與傳統(tǒng)的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領(lǐng)域。
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術(shù)問世于20世紀70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理是，按照兩個核酸的堿基序列互補原則，用特殊修飾的核苷酸分子標記DNA探針，然后將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定量。
熒光原位雜交（FISH）的實驗步驟：
1. 玻片處理
2. 樣品制備及其所涉及的試劑包括
3. 取樣及保存方法
4. 樣品固定
5. 樣品雜交
6. DAPI染色
7. 封片熒光顯微鏡進行檢測
FISH實驗關(guān)鍵因素：
1.溫度
FISH實驗溫度直接影響探針雜交效率，實驗中要求對相關(guān)儀器溫度溫差小于0.5℃，且實驗環(huán)境溫度要求20℃以上，一次實驗操作不宜超過四張玻片，盡量保證實驗溫度一致。
2.濕度
FISH實驗中適度同樣直接影響雜交效率，尤其預(yù)雜交，雜交過程中需在濕盒中加入預(yù)雜交液/雜交液以保持環(huán)境濕度。
3.光照
FISH探針標記有熒光染料，光照影響熒光染料強度，實驗過程中應(yīng)注意避光，實驗完成后盡快滴加熒光保護劑封片，并避光保存。
4.PH值
FISH實驗對各試劑pH值要求嚴格，試劑pH值直接影響實驗穩(wěn)定性，每次實驗試劑都需現(xiàn)用現(xiàn)配，精確調(diào)節(jié)pH值，且實驗用水使用滅菌去離子水。
FISH技術(shù)優(yōu)勢：操作簡單、檢測快速、結(jié)果易觀察、可檢測多種類樣品、空間定位準確、靈敏性和特異性高。
應(yīng)用[8]
FISH臨床意義有指導(dǎo)臨床治療及藥物選擇、疾病的分期分型及預(yù)后判斷、形態(tài)學檢測的輔助手段。
例如在FISH技術(shù)在骨髓增生異常綜合征中的應(yīng)用與PRAME基因在骨髓增生異常綜合征表達的研究中對MDS患者進行常規(guī)細胞遺傳學顯帶分析(CC)和FISH檢測,建立在MDS診斷過程中的規(guī)范化的FISH檢測平臺；比較FISH與常規(guī)細胞遺傳學方法在檢測MDS染色體異?？寺≈械牟町?探討FISH在MDS診斷中的地位。同常規(guī)細胞遺傳學顯帶分析(CC)不同,熒光原位雜交技術(shù)(FISH)不需要細胞培養(yǎng),利用位點特異性基因探針可以檢測間期細胞的克隆性染色體改變,并可以檢測出10-20%左右核型正常的MDS的異常克隆。應(yīng)用FISH技術(shù),可以提高MDS患者染色體異常檢出率,為診斷和治療提供幫助。
參考文獻
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