背景^[1-3]

RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系是一種來(lái)源于人類惡性胚胎橫紋肌瘤(RD)的細(xì)胞系。RD是一種罕見(jiàn)的惡性腫瘤，起源于胚胎期的橫紋肌組織，通常發(fā)生在兒童和青少年。RD細(xì)胞系的建立有助于研究RD的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制以及潛在的治療方法。

RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)：

形態(tài)特征：RD細(xì)胞呈長(zhǎng)條形或多角形，具有多個(gè)突起，核較大，核質(zhì)比高。

生長(zhǎng)特性：RD細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，分裂能力強(qiáng)，可以在體外持續(xù)傳代。

黑色素生成能力：RD細(xì)胞具有黑色素生成能力，因此常用于研究黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療。

藥物敏感性：RD細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物具有敏感性，因此常被用于藥物篩選和藥效評(píng)價(jià)。

基因表達(dá)特征：RD細(xì)胞具有一些與惡性胚胎橫紋肌瘤相關(guān)的基因表達(dá)特征，如MYCN、CDK4等基因的高表達(dá)。

RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系

RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系可以用于組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA抑制RD細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

研究SAHA對(duì)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、自噬和遷移能力的影響,并探索其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。

方法:不同濃度SAHA作用于RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞,MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響,western blot檢測(cè)ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá);PI染色法分析細(xì)胞周期;Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,DAPI染色法驗(yàn)證細(xì)胞凋亡,然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)初步探討誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制:用JC-1探針檢測(cè)線粒體膜電位的變化;western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、線粒體途徑相關(guān)蛋白的變化;MDC染色法檢測(cè)細(xì)胞自噬,western blot檢測(cè)自噬相關(guān)的蛋白的表達(dá);細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;western blot檢測(cè)細(xì)胞組蛋白H4的乙?；?。

結(jié)果:1.saha抑制了rd細(xì)胞的增殖,并且具有時(shí)間和濃度依賴性。saha作用于RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞24h、48h、72h的半數(shù)抑制率ic50值分別為8.503μmol//l、3.965μmol/l和1.921μmol/l;與rd細(xì)胞增殖相關(guān)erk信號(hào)通路的變化是:erk蛋白磷酸化水平下降,而總erk蛋白水平?jīng)]有顯著的變化;

2. 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示saha使RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞發(fā)生g2/m期阻滯;

3. annexinv-fitc/pi雙染法結(jié)果顯示saha能夠誘導(dǎo)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞凋亡;dapi染色法實(shí)驗(yàn)表明,隨著saha濃度的增加,凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨之增加,jc-1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,隨著saha濃度的增高,rd細(xì)胞線粒體膜電位水平逐漸降低;westernblot結(jié)果顯示:隨著saha濃度的增高,凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和parp-1表達(dá)量增高,抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)量逐漸減低,促凋亡蛋白bax表達(dá)量逐漸增加,細(xì)胞色素c和caspase-9的表達(dá)也均有所增加;

4. saha使RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞發(fā)生自噬:mdc染色結(jié)果顯示隨著saha濃度的增高,細(xì)胞內(nèi)的高亮點(diǎn)狀綠色熒光的斑點(diǎn)數(shù)量逐漸增多,表明細(xì)胞發(fā)生自噬。westernblot結(jié)果顯示:隨著saha濃度的增高,p62蛋白表達(dá)逐漸減少,beclin1蛋白表達(dá)水平逐漸增高,lc3-Ⅱ蛋白的表達(dá)也顯著增高。

5. saha抑制RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞的遷移:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著saha濃度的增高,劃痕愈合率逐漸降低。

6. westernblot結(jié)果顯示:隨著saha濃度的增高,RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系組蛋白h4的乙?；街饾u增高。

結(jié)論:1.hdac抑制劑saha抑制RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞的增殖,使RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞發(fā)生g2/m期阻滯,該抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性;

2. hdac抑制劑saha誘導(dǎo)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡,介導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能為依賴于線粒體途徑和具有caspase依賴性;

3. hdac抑制劑saha誘導(dǎo)RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞自噬;

4.hdac抑制劑saha抑制RD人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞系細(xì)胞的遷移能力。

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