背景[1-3]
OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系是一種用于研究卵巢癌的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系由日本學(xué)者于2007年建立，來源于一名53歲的女性卵巢黏液性癌患者的腹水。該細(xì)胞系具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，可以作為研究卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的模型之一。
OVISE細(xì)胞系的建立對(duì)于卵巢癌的研究具有重要意義。通過使用這種細(xì)胞系，科學(xué)家們可以研究卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性、分子機(jī)制和藥物敏感性等。此外，OVISE細(xì)胞系還可以作為篩選和評(píng)估卵巢癌治療藥物的模型之一，為卵巢癌的治療提供重要的參考依據(jù)。
OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系
OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作:
1)復(fù)蘇OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4-5]
OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系可以用于順鉑對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控在卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制研究
研究方法:(1)分別用PMA和M-CSF刺激THP1細(xì)胞和人外周血單核細(xì)胞(PBMC),使其誘導(dǎo)成為未活化的巨噬細(xì)胞Mφ,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)效果;然后用LPS/IFN-γ誘導(dǎo)Mφ成為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(CAM),并通過Real-time PCR驗(yàn)證誘導(dǎo)效果。Transwell法檢測(cè)經(jīng)化療藥物順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺和紫杉醇作用的Mφ和CAM的條件培養(yǎng)基(CM)對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780和SKOV3侵襲和遷移能力的影響;Western blot檢測(cè)經(jīng)順鉑作用的Mφ條件培養(yǎng)基(Cis-Mφ-CM)和CAM條件培養(yǎng)基(Cis-CAM-CM)對(duì)A2780細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;Real-time PCR檢測(cè)經(jīng)順鉑作用后的CAM中極化指標(biāo)的變化;CCK8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)Cis-CAM-CM對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780及SKOV3增殖和凋亡的影響;經(jīng)Cis-CAM-CM作用后,CCK8法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。
(2) 通過Luminex液體懸浮芯片檢測(cè)順鉑處理前后的巨噬細(xì)胞CM中的細(xì)胞因子的濃度,篩選差異蛋白,并通過Real-time PCR和ELISA分別驗(yàn)證差異基因在m RNA及蛋白水平的表達(dá),確定候選蛋白;用候選蛋白的人源重組蛋白作用于卵巢癌細(xì)胞,CCK8法檢測(cè)候選蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響,transwell法檢測(cè)候選蛋白對(duì)細(xì)胞遷移的影響;采用候選蛋白的中和抗體阻斷Cis-Mφ-CM和Cis-CAM-CM中的候選蛋白,transwell法檢測(cè)其對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響;采用si RNA敲低A2780和SKOV3中的CCR6表達(dá),Real-time PCR及Western blot驗(yàn)證敲低效果,CCK8法檢測(cè)Cis-CAM-CM對(duì)CCR6-KD卵巢癌細(xì)胞增殖的影響,transwell法檢測(cè)Cis-CAM-CM對(duì)CCR6-KD卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響,Western blot檢測(cè)Cis-CAM-CM對(duì)CCR6-KD卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
(3)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)CCR6在人源永生化卵巢上皮細(xì)胞IOSE和卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3、A2780、HO8910、OVCAR3、OVISE人卵巢癌貼壁細(xì)胞系、ES2、HEY)中的表達(dá);CCK8法和Transwell法分別檢測(cè)rh CCL20對(duì)卵巢癌細(xì)胞株增殖和遷移的影響;采用si RNA敲低A2780和SKOV3細(xì)胞中的CCR6表達(dá),以及Crispr-cas9技術(shù)敲除A2780中CCR6的表達(dá),transwell法檢測(cè)遷移能力的變化,以及rh CCL20對(duì)其遷移能力的變化;Western Blot檢測(cè)A2780和SKOV3細(xì)胞經(jīng)rh CCL20作用后MAPK信號(hào)和Akt信號(hào)通路的激活情況;構(gòu)建裸鼠腹腔移植瘤模型,檢測(cè)CCL20-CCR6軸在體內(nèi)卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中的作用;采用KM plotter分析卵巢癌組織中CCR6表達(dá)與卵巢癌病人預(yù)后的相關(guān)性,采用基因富集分析探討卵巢癌組織中CCR6表達(dá)與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因集表達(dá)的相關(guān)性。
參考文獻(xiàn)
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